我國近5年類NADC30 PRRSV毒株序列的重組及限制性片段長度多態性分析

王 彪,谷尚品,侯曉璇,王孟月,王小娟,譚菲菲*,田克恭,*

(1.河南農業大學 動物醫學院,河南 鄭州 450046;2.國家獸用藥品工程技術研究中心,河南 洛陽471000)

豬繁殖與呼吸綜合征(porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS)是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)引起的一種高度傳染性疾病,給養豬業造成了重大的經濟損失[1]。PRRSV屬動脈炎病毒科,是一種有包膜的單股正鏈RNA病毒,基因組長度約為15 kb。根據基因序列和抗原特性之間的差異,可進一步分為歐洲型(PRRSV-1)和美洲型(PRRSV-2)[2-3]。

1996年PRRSV首次在我國華北地區報道[4]。隨著PRRSV不斷變異和傳播,以高熱、高流產率、高病死率為特點的高致病性PRRS(highly pathogenic PRRSV,HP-PRRS)于2006年暴發,重創了我國養豬業,造成超過2 000萬頭豬受到影響,其代表性毒株為JXA1[5]。2014年,周峰等[6]等報道了河南地區類NADC30的流行,其非結構蛋白2(nonstructural protein 2,Nsp2)與美國2008年分離的NADC30毒株均存在131(111+1+19)個不連續氨基酸缺失,因此將此類毒株命名為類NADC30。隨后,類NADC30毒株的臨床檢出數量急劇增加,并且病毒的重組事件頻頻發生,使PRRSV多樣性顯著擴大[7]。

Nsp2和ORF5是PRRSV基因組中兩個高變區域,其中ORF5基因在免疫應答的調節中起著關鍵作用。基于PRRSV ORF5序列遺傳演化分析和序列之間的同源性,可將PRRSV-2分為9個不同的譜系:Lineage 1～Lineage 9[8],該方法也是目前PRRSV-2比較公認的分類法。另一種序列分類方法是1998年美國學者[9]以PRRSV-2建立的限制性片段長度多態性(restriction fragment length polymorphis,RFLP)分類方法,根據ORF5序列中MluⅠ、HincⅡ和SacⅡ的酶切模式,并分配3個數字代碼進行命名。RFLP分類方法在美國養豬行業普遍使用,可用于區分PRRSV-2野毒株與VR2332弱毒疫苗株。

2020年10月,美國中西部養豬場報道了HP-PRRSV RFLP1-4-4 Lineage1C變異株,其對豬致死率高達17.5%[10],且疫苗對其保護效果不佳。鑒于我國2003年就存在PRRSV RFLP1-4-4模式[11],并且PRRSV毒株頻繁發生突變和重組。因此本研究對實驗室類NADC30 PRRSV 株與參考毒株進行遺傳演化分析與RFLP分析,旨在了解我國近年來類NADC30的遺傳演變規律,為PRRSV流行株的防控提供借鑒資料。

1 材料與方法

1.1 樣本信息本實驗室自2016-2020年從我國15個省份(河南、江蘇、山東、山西、陜西、天津、重慶、浙江、吉林、福建、遼寧、江西、黑龍江、河北、四川)的豬場采集1 747份組織和血清樣品中檢測到263份類NADC30樣品,選擇64份代表性樣品進行全基因序列測定。同時從NCBI中選擇21條參考毒株序列用于分析,參考序列如表1所示。

1.2 序列比對和遺傳演化分析根據經典毒株VR2332序列注釋對本研究中的序列進行分割,得到各毒株的Nsp2序列。利用DNAStar軟件中MegAlign對64株毒株與參考毒株的Nsp2推導氨基酸序列進行比對,分析各毒株的Nsp2缺失特征。使用MEGA11(鄰近法,步長值為1 000)對64株毒株與代表性毒株進行全基因組和ORF5序列遺傳演化分析。

表1 PRRSV參考毒株信息

1.3 重組分析選取各譜系5個代表性毒株作為參考毒株:NADC30、NADC34、QYYZ、VR2332、JXA1。通過SimPlot(v3.5.1)軟件對本研究的64條全基因組序列進行全基因組重組事件的初步檢測,然后使用RDP4(v4.97)軟件對重組毒株進行分析,當7種方法(RDP4、GENECONV、MaxChi、BootScan、SiScan、Chimaera、3Seq)中至少有4種方法檢測到重組事件(P-val<10-6)時,認為該序列中可能有重組事件的發生。最后,計算重組毒株的相同重組斷點數量占總重組毒株的比例為重組熱點。

1.4 ORF5序列的RFLP模式分析以NADC30毒株ORF5序列為參考,截取本研究64條毒株ORF5基因序列。通過SnapGene軟件對64條NADC30毒株ORF5序列分別進行MluⅠ、HincⅡ、SacⅡ 3種限制性內切酶的模擬酶切,依據RFLP模式分析進行劃分。

2 結果

2.1 Nsp2序列特征64株分離株Nsp2推導氨基酸與參考毒株R2332比對結果顯示,其Nsp2在322～432,483,504～522氨基酸位置均存在131(111+1+19)個氨基酸的不連續缺失,與代表性毒株NADC30缺失特征一致,表明64株毒株屬于類NADC30毒株。此外,其中有9個毒株含有額外的氨基酸缺失(圖1),毒株171365-4、2015HeNP183、161343-1、161433-57在464～468氨基酸位置缺失,毒株170546-2、180411-12、180546-27在18～23氨基酸位置缺失,毒株56full在459～489氨基酸位置缺失, 毒株181120-4在465～467氨基酸位置缺失。

橘色代表Nsp2 131個氨基酸的不連續缺失;藍色代表毒株的Nsp2額外氨基酸缺失

2.2 遺傳演化分析為了建立64株毒株與參考毒株的遺傳關系,基于全基因組和ORF5序列進行遺傳演化分析。全基因遺傳演化分析結果(圖2)顯示,61株分類在Sublineage 1.8屬于類NADC30亞群,其余毒株180049-1、56full、161433-57分類在Lineage 8,屬于HP-PRRSV,PRRSV RFLP 1-4-4 L1C變異株分類在Sublineage 1.5,屬于類NADC34亞群。而基于ORF5序列遺傳演化分析結果(圖3)顯示,56株毒株與PRRSV RFLP 1-4-4 L1C變異株分類在Sublineage 1.8,其余8株中56full、180049-1、170407-41、161401-3、180991-3分類在Lineage 8,20200714-2分類在Sublineage 1.5,161302-14、171365-4分類在Lineage 5,屬于VR2332亞群。由此可見基于ORF5的遺傳演化分析分出譜系更多,表明這些毒株可能存在著重組現象。

2.3 全基因組序列重組分析為了解64株分離株是否存在重組事件,以各譜系代表性毒株作為參考毒株,使用RDP4和Simplot軟件對64條毒株全基因組序列進行重組分析,64株毒株中有44株存在重組事件(表2,僅展示5種方法的結果),共5種重組模式。最主要的重組模式是以NADC30毒株作為親本,JXA1毒株提供重組片段。其余4種重組模式分別是:以JXA1為親本毒株,NADC30毒株提供重組片段的重組模式(161433-57、56full、180049-1);以NADC30為親本毒株,JXA1和VR2332毒株提供重組片段的重組模式(170438-1、180450-1、2016-32、161302、171365-4、171388-1、180613-4、181425-3、181566-4);以NADC30毒株為親本,JXA1和QYYZ毒株提供重組片段的重組模式(16448-2、170028-2、170051-4、16756-1、170097-1);以NADC30毒株為親本,NADC34毒株提供重組片段的重組模式(20200714-2)。根據參考毒株VR2332基因序列確定重組片段的位置,結果顯示重組熱點主要聚集在非結構蛋白區域5′UTR～1 500 nt(Nsp1)以及5 374～8 177 nt(Nsp4～Nsp9)和結構蛋白區域的12 100～13 279 nt(ORF2～ORF4)(圖4A,B,C)。

2.4 ORF5序列的RFLP模式分析結果如圖5所示,64株分離株ORF5序列的RFLP模式呈現多樣性,數量最多的模式為RFLP1-4-4(31株),其次是1-2-4(9株)、1-4-3(7株)、1-3-4(5株)、1-1-4(4株)、2-5-5(2株)等。結合ORF5序列的遺傳演化分析結果,31株RFLP1-4-4模式中有28株與美國PRRSV RFLP1-4-4L1C變異株分類在Sublineage 1.8,2株毒株170407-41、161401-3分布在Lineage 8,1株20200714-2分類在Sublineage 1.5。RFLP1-4-3(7株)類型中56full、180049-1、180991-3分類在Lineage 8,其余4株分類在Sublineage 1.8。RFLP2-5-2模式的毒株161302-14、171365-4分類在Lineage 5,ORF5序列與經典毒株VR2332的RFLP模式相同,且ORF5序列具有99.4%和99.9%的一致性。其余模式(1-2-4、1-3-4、1-1-4)毒株均屬于Sublineage 1.8。

▲表示參考毒株;◆表示美國PRRSV RFLP1-4-4 Lineage1C變異株

▲表示參考毒株;◆表示美國PRRSV RFLP1-4-4 Lineage1C變異株

A.參照VR2332株全長基因組結構;B.重組毒株斷點位置;C.重組斷點位置熱點分布圖

表2 類NADC30毒株重組事件信息

續表2

圖5 64株類NADC30 PRRSV ORF5 RFLP模式

3 討論

PRRS被認為是我國養豬業中最具流行性和破壞性的疾病,自2006年HP-PRRS暴發,PRRSV在我國的流行就經歷了HP-PRRSV和類NADC30毒株之間交替優勢的階段[12]。近年來,研究表明類NADC30毒株的流行不斷擴大,并逐漸成為我國的主要流行毒株[7],引起了業界的廣泛關注。

Nsp2是PRRSV全基因組中高度變異的區域之一,包含缺失、重組和插入多種突變模式,常被作為區分不同毒株類型的分子標記[13]。與經典毒株VR2332相比,本研究64條Nsp2氨基酸序列除具有與NADC30毒株缺失特征一致的131個不連續氨基酸缺失以外,毒株171365-4、2015HeNP183、161343-1、161433-57在464～468氨基酸位置含有額外的缺失,這與2016年報道的分離毒株HeN1401、HeN1601研究結果相同[14]。而毒株170546-2、180411-12、180546-27、56full、181120-4在Nsp2氨基酸序列中呈現出了新的缺失,這體現了我國類NADC30毒株在Nsp2區域具有復雜的缺失模式,且在持續的變異中。但不同類型的缺失與毒力等生物學特性之間是否相關還需要進一步的研究。

PRRSV-2是我國主要的流行毒株,可根據其高變異區ORF5序列、Nsp2序列以及全基因組序列將其劃分為不同的分支來探究遺傳演化規律。目前,我國PRRSV-2主要流行譜系為Lineage1、3、5、8[15]。為了更全面了解類NADC30毒株的遺傳演化關系,本研究分別選擇Lineage 1～9的代表性毒株進行分析?；贠RF5序列和全基因組序列遺傳演化分析結果發現,多個毒株在ORF5序列系統進化樹和全基因組系統進化樹中的分布存在差異,表明這些毒株的基因組中可能存在著重組現象,同時表明僅依賴ORF5序列分型不能夠全面代表病毒的序列變異情況。

重組在PRRSV中普遍存在,我國多譜系毒株的共存會產生多種模式的重組毒株,進一步造成病毒基因組遺傳的多樣性,從而導致PRRS的防控形勢更加嚴峻。2006-2011年期間,我國PRRSV一直保持著較低的重組率,隨著類NADC30毒株的流行,我國重組毒株的檢出數量急劇增加[16]。本研究中64株類NADC30毒株有44株存在重組事件,并表現出復雜的重組模式,重組位點幾乎分布于整個基因組,其中毒株56full、180049-1、170407-41、161401-3、180991-3、161302-14、171365-44、20200714-2在ORF5區域與其他譜系毒株序列發生重組,該結果也進一步解釋了這些毒株在基于ORF5序列和全基因組序列的系統進化樹中位置存在差異的原因。另外,毒株161302-14、171365-4、171388-1是NADC30毒株與VR2332弱毒疫苗株之間發生重組,表明PRRSV重組不僅在野毒株與野毒株之間發生,在野毒株與疫苗株之間也時有發生,并且會改變毒株的致病性[17-19]。對44株毒株重組位點進一步分析發現重組熱點主要聚集在Nsp1、4～9和ORF2～ORF4區域,有研究表明,Nsp通過不同機制調控宿主抗病毒免疫反應,其Nsp9編碼的蛋白與病毒的復制過程密切相關,而ORF2、ORF3、ORF4進行編碼蛋白所形成的異源三聚體是促使PRRSV感染的主要決定因素[20]。因此PRRSV在這些區域發生重組是否會導致重組毒株具有更強的增殖能力仍需進一步的研究。

目前,我國PRRSV毒株主要以分支譜系進行分類命名,但鑒于我國PRRSV毒株有美國毒株傳入的先例,有時也沿用RFLP分類進行毒株的分析。2020年10月美國暴發的RFLP 1-4-4 L1C變異株具有較高的致病性,且可能是以類NADC34為親本,類NADC30在ORF5區域提供重組片段的重組毒株[21-22]。本研究中,共發現31株是RFLP1-4-4模式,其中28株與2020年10月美國暴發的RFLP 1-4-4 Lineage1C變異株在遺傳演化分析中都屬于相同的分支,但分離株樣本信息中,未有類似美國PRRSV RFLP 1-4-4 Lineage1C變異株導致大規模發病的報道。其原因可能為:一方面,影響PRRSV毒力的相關因素受到病毒基因組中的多個基因所決定[13],而RFLP 1-4-4 L1C類毒株是基于ORF5序列進行分析,ORF5序列僅占PRRSV全基因組序列長度的4%,因此該方法在展示毒株遺傳多樣性上存在著一定的局限性,并不能反映出PRRSV全基因組遺傳演變特征;另一方面,重組也是導致毒株多樣性的原因,不同的重組位置、重組片段長度、重組模式均會產生不同的生物學特征。

綜上,本研究基于64條類NADC30毒株全基因組序列進行分析,發現我國類NADC30毒株呈現復雜的Nsp2區域缺失模式和重組模式,豐富了類NADC30毒株的基因組信息。另外,目前尚不清楚美國PRRSV RFLP 1-4-4 Lineage1C變異株是否已傳入我國豬群,應加強在肉類進口的檢疫以及對國內豬群的流行病學監測,同時關于我國RFLP1-4-4 Lineage1C毒株的流行與變異情況仍需密切關注。