表達高致病性和NADC30樣PRRSV毒株GP5蛋白的重組偽狂犬病病毒的構建

王林青,侯承堯,馬 曉,劉 穎,劉 芳,金 鉞*,陳紅英*

(1.河南農業大學 動物醫學院,河南 鄭州450046;2.鄭州師范學院 分子生物學鄭州市重點實驗室,河南 鄭州 450044)

豬繁殖與呼吸綜合征(porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS)是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)引起的一種急性傳染病,其特征為母豬繁殖障礙和各個年齡段豬呼吸系統疾病[1-3]。20世紀90年代,PRRS在美國和歐洲相繼出現,隨后傳至全球,嚴重危害養豬業可持續發展。PRRSV是一種有囊膜、單鏈正義RNA病毒[4],其表面包含至少7個膜蛋白,其中GP5是一種相對分子質量約為25 kDa的跨膜蛋白,攜帶能誘導機體產生中和抗體的中和表位,是研制新型PRRSV疫苗的熱門靶點。基于GP5基因序列構建的全球分類體系,PRRSV-1分為3個亞型(亞型1～3),PRRSV-2分為9個譜系,譜系下再分多個子譜系[4-5]。臨床上出現新的PRRSV毒株往往會導致PRRS的再次廣泛流行。2006年,我國豬群中出現高致病性PRRSV (HP-PRRSV)毒株,導致PRRS大流行,豬病死率為20%[6]。2013年,我國再次流行PRRS,研究表明出現了一種新的PRRSV變異體——NADC30-like PRRSV毒株,已證實該毒株為PRRSV NADC30毒株從北美傳入我國,與國內HP-PRRSV毒株發生重組,并在我國豬群中適應的毒株[7-8]。目前尚無基于NADC30-like PRRSV毒株開發的商業PRRSV疫苗。因此,開發一種針對NADC30-like PRRSV的PRRSV疫苗,對于控制持續增加的NADC30-like PRRS疫情尤為重要。

偽狂犬病(pseudorabies,PR)是由偽狂犬病病毒(PRV)引起多種動物共患的一種急性傳染病[1]。豬是PR的自然儲存宿主,各年齡階段豬都受到PR的威脅[9]。于2011年底,PR在我國北方省份很多接種了Bartha-K61疫苗的農場中暴發與流行,隨后迅速蔓延到我國多個省份[10],對我國養豬業造成毀滅性打擊。經研究發現,新一輪暴發的PR是由PRV變異株導致的,且現有的疫苗只能提供部分保護,且抗體陽性率逐年上升[10]。PRV基因組為雙鏈線狀約150 kb DNA,其中有近70個開放閱讀框,編碼出70～100個病毒蛋白[11]。PRV的龐大基因組包含許多非必需基因和許多插入位點,包括TK、gE、gI和gG基因,可以整合和表達外源基因。這些非必需基因的缺失導致病毒的毒力表型減弱,而對免疫反應沒有顯著影響[11]。

利用同源重組技術,本研究將2種不同亞型PRRSV GP5基因插入PRV變異株3基因缺失株rPRV-gE-/gI-/TK-基因組中,并利用CRISPR/Cas9系統,構建了能穩定表達NADC30-like PRRSV GP5蛋白和HP-PRRSV GP5蛋白的重組PRV毒株,以期為PRRS和豬PR的防治提供一種新型疫苗奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 質粒、細胞和毒株pBApo-EF1α_Pur_DNA真核表達載體購自寶生物工程有限公司;PRV轉移質粒pG-GP5/HP-EGFP(含HP-PRRSV GP5基因)、敲除質粒CRISPR/Cas9-gG、ST細胞以及rPRV-gE-/gI-/TK-毒株均由鄭州豬重大疫病防控重點實驗室構建和保存。

1.2 主要試劑與儀器TRIzol、HiScript?Ⅱ1st Strand cDNA Synthesis Kit和Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase購自南京諾維贊生物科技有限公司;DNA凝膠回收試劑盒、Endo-Free Plasmid Mini Kit Ⅰ-fast購自OMEGA公司;小牛腸堿性磷酸酶(CIAP)、BamHⅠ、HindⅢ和Bst Z17I等購自寶生物工程(大連)有限公司; SE Seamless Cloning and Assembly Kit、轉染試劑ZLip2000購自北京莊盟國際生物基因科技有限公司;DMEM、2×DMEM培養基購自武漢博士德生物公司;低熔點瓊脂糖、OPTI-MEM無血清培養基購自北京索萊寶科技有限公司。

1.3 引物設計與合成根據NADC30-like PRRSV分離株HENAN-XINX基因組序列 (GenBank 登錄號:KF611905)中GP5基因,設計1對特異性引物(表1),BamHⅠ(GGATTC)和HindⅢ(AAGCTT) 分別引入到引物的5′端,并在上游引物BamHⅠ位點后引入Kozak序列(GCCACC),用于擴增PRRSV毒株GP5基因。基于pBApo-EF1α_Pur_DNA中表達盒插入質粒pG-GP5/HP-EGFP中Bst Z17I位點,設計1對含左右同源臂的引物T-pBA-F/R。引物EGFP-F/R用于鑒定EGFP基因的表達盒。引物均由北京擎科生物科技有限公司合成。

表1 引物信息

1.4 質粒pG-GP5/HP-GP5/NADC30-EGFP的構建用TRIzol試劑提取NADC30-like PRRSV毒株總RNA,按照HiScript?Ⅱ1st Strand cDNA Synthesis Kit說明合成cDNA,利用引物GP5-NA-F/R進行PCR擴增GP5基因。RT-PCR產物通過BamHⅠ和HindⅢ克隆到載體pBApo-EF1α_Pur_DNA中,構建重組質粒pBA-GP5/NADC30(圖1),導入DH5α感受態細胞,挑取單個菌落,用引物GP5-NA-F/R進行PCR鑒定并提取質粒進行測序。

圖1 轉移質粒pG-GP5/HP-GP5/NADC30-EGFP的構建示意圖

以重組質粒pBA-GP5/NADC30 DNA為模板,利用T-pBA-F/R為引物,PCR擴增GP5/NA表達盒,并純化回收擴增產物。用SE Seamless Cloning and Assembly Kit,將含有同源臂的GP5/NA表達盒和用Bst Z17I酶切并用CIAP去磷酸化的質粒pG-GP5/HP-EGFP進行無縫克隆連接,構建重組質粒pG-GP5/HP-GP5/NADC30-EGFP(圖1),37℃水浴作用30 min,導入 DH5α感受態細胞中,用引物GP5-NA-F/R和T-pBA-F/R對選取的單個菌落進行PCR鑒定。提取質粒,以T-pBA-F/R為引物進行測序。

1.5 重組病毒rPRV-GP5/HP-GP5/NADC30-EGFP的拯救用Endo-Free Plasmid Mini KitⅠ-fast去內毒素質粒抽提試劑盒按照說明提取轉移質粒pG-GP5/HP-GP5/NADC30-EGFP。在長至80%單層ST細胞6孔板內接種3基因缺失PRV親本株rPRV-gE-/gI-/TK-,37℃、5% CO2培養2 h后,將轉移質粒pG-GP5/HP-GP5/NADC30-EGFP按照轉染試劑ZLip2000說明進行轉染。37℃、5% CO2孵育5 h后,棄細胞液,添加新鮮培養液,繼續培養至出現細胞病變(CPE),反復凍融細胞,收獲病毒液。

將病毒液按照10-1,10-2,10-3,10-4,10-5倍比梯度稀釋后,接種于長滿至80% 6孔板的單層ST細胞,在37℃、5% CO2細胞培養箱內培養2 h,吸棄孔內細胞液,并用含1.3%低熔點瓊脂糖、5%胎牛血清DMEM培養基鋪板進行重組病毒的蝕斑篩選。每次病毒純化都選取稀釋度最大孔內的單個綠色熒光病變灶進行下一輪病毒純化,將收取的病毒液反復凍融3次后重復上述步驟,直至稀釋孔內的所有病變灶均呈現綠色熒光時,提取病毒DNA,用引物GP5-NA-F/R進行PCR鑒定。

1.6 重組病毒rPRV-GP5/HP-GP5/NADC30的拯救將rPRV-GP5/HP-GP5/NADC30-EGFP接種已轉染敲除質粒CRISPR/Cas9-EGFP 并37℃、5% CO2孵育5 h后的單層ST細胞,37℃、5% CO2孵育2 h,吸棄孔內細胞液,加入新鮮培養液,出現CPE時收獲病毒細胞液。蝕斑純化同1.5,但是選取稀釋度最大孔內的無綠色熒光病變灶,直到所有稀釋孔內的所有病變灶均不出現綠色熒光時,提取病毒DNA,用引物GP5-NA-F/R和EGFP F/R進行PCR擴增。

1.7 GP5基因在ST細胞中轉錄鑒定將重組病毒rPRV-GP5/HP-GP5/NA接種于長至80%融合ST細胞中,37℃、5% CO2中培養。當約80%細胞出現CPE時,收集病毒細胞液,反復凍融3次,用TRIzol試劑提取病毒RNA,并用HiScript?Ⅱ 1st Strand cDNA Synthesis Kit進行反轉錄為cDNA,利用引物GP5-NA-F/R進行PCR擴增。

2 結果

2.1 重組質粒pBA-GP5/NADC30的鑒定將選取的單個菌落接種到液體培養基中培養后提取質粒,利用引物GP5-NA-F/R和T-pBA-F/R進行PCR鑒定。結果顯示,在630 bp處出現1條特異性條帶(圖2),與預期擴增GP5基因長度相符。對表達盒的擴增,呈現1條約2 000 bp特異性條帶,經測序證實結果正確。表明已成功構建質粒pBA-GP5/NA。

2.2 轉移質粒pG-GP5/HP-GP5/NADC30-EGFP的鑒定以重組質粒pG-GP5/HP-GP5/NADC30-EGFP轉化后的菌液為模板,利用引物GP5-NA-F/R和T-pBA-F/R,PCR擴增GP5基因和表達盒。結果顯示,在約630,2 000 bp處分別呈現1條特異性條帶(圖3),與預期擴增片段相符,且測序結果也正確,表明已成功構建質粒pG-GP5/HP-GP5/NADC30-EGFP。

M.DL2000 DNA Marker;1～3.GP5基因PCR產物;4～6.表達盒PCR產物

M.DL2000 DNA Marker;1～4. GP5基因PCR產物;5～8. 表達盒PCR產物

2.3 rPRV-GP5/HP-GP5/NADC30-EGFP的綠色熒光觀察和PCR擴增轉染ST細胞24 h后,細胞對照組和空白轉染組在熒光顯微鏡下無綠色熒光(圖4),而質粒pG-GP5/HP-GP5/NADC30-EGFP轉染孔呈現明顯的綠色熒光。提取病毒DNA,使用GP5基因特異性引物GP5-NA-F/R進行PCR擴增,結果顯示,在約630 bp處有1條特異性條帶(圖5),與預期相符。

A.試驗組;B.細胞對照組;C.空白轉染組

M.DL2000 DNA Marker;1.GP5/HP PCR產物;2.陰性對照

2.4 rPRV-GP5/HP-GP5/NADC30的綠色熒光觀察和PCR擴增對獲得的含rPRV-GP5/HP-GP5/NADC30細胞液,經4輪蝕斑純化,觀察到所有病變灶已無綠色熒光(圖6)。提取rPRV-GP5/HP-GP5/NADC30基因組,利用引物GP5-NA-F/R,PCR擴增GP5基因,擴增出1條約630 bp的片段(圖7),與預期擴增片段大小相符。利用引物EGFP-F/R進行PCR擴增,擴增出1條約400 bp的片段,經測序顯示,序列長度為436 bp,重組病毒中EGFP基因缺失了1 232 bp片段,表明重組病毒rPRV-GP5/HP-GP5/NADC30中的EGFP基因被成功敲除,且經空斑純化完全。

2.5 GP5基因在ST細胞中的轉錄鑒定提取rPRV-GP5/HP-GP5/NADC30感染的病變ST細胞總RNA,反轉錄出cDNA,利用GP5基因特異性引物GP5-NA-F/R進行PCR擴增。結果顯示,在約630 bp處呈現1條特異性條帶(圖8),與預期相符,且測序結果正確,表明成功構建重組病毒rPRV-GP5/HP-GP5/NADC30。

A.白光下觀察結果;B.藍光下觀察結果

M.DL2000 DNA Marker;1～4.GP5基因PCR產物;5～8.EGFP基因PCR產物;9.陰性對照

M.DL2000 DNA Marker;1.PCR產物;2.陰性對照

3 討論

PRRS仍然是養豬業面臨的主要挑戰,每年都會造成重大經濟損失。疫苗免疫依舊是控制PRRSV暴發和流行的重要手段。PRRSV的持續變異,導致多亞型毒株同時暴發和流行,使得PRRS的預防和控制更加復雜[12]。與HP-PRRSV株相比,NADC30-like PRRSV毒株是我國近年來主要流行毒株,檢出率第二[13]。盡管其致病性低于HP-RRRSV,但是極易與其他PRRSV發生重組,導致其致病性發生變化。目前市面上的基于經典PRRSV和HP-PRRSV毒株的商用PRRSV疫苗是否能夠預防PRRSV新亞型毒株的感染,還有待進一步證實。利用NADC30-like PRRSV毒株進行攻毒保護試驗,發現我國應用最廣泛的商品疫苗都不能有效保護豬免受該毒株的攻擊。疫苗免疫后,感染NADC30-like PRRSV毒株的豬仍出現明顯的臨床癥狀,高病毒血癥,且各組織病毒載量高[14-15]。先前的多項研究已經確定了分布在主要結構蛋白(GP5和M)和次要糖蛋白(GP2a、GP3和GP4)上的多個中和表位,GP5中和抗體可部分預防廣泛性病毒血癥和PRRSV感染后肺部病變的發展[16]。我國流行的不同亞型PRRSV毒株GP5同源性在83.4%～99.8%之間, PRRS防控失敗的原因之一可能是現有疫苗不能產生交叉保護[17]。有研究表明PRRSV GP5與多基因共同表達可產生比單獨GP5蛋白更高的抗GP5中和抗體[18]。

通過基因缺失減毒的PRV活病毒載體表達外源基因是一種非常成熟的抗原呈遞系統。目前,PRV已經發展成為一種表達外源性蛋白的強大載體體系,可以攜帶和表達其他病毒的主要免疫原性基因和蛋白,如PCV3 Cap、ASFV CD2v、HP-PRRSV GP5等[19-21]。這些用PRV活病毒載體研制的二價或三價重組疫苗,可以刺激機體產生針對目標病毒的特異性免疫反應,而不影響PRV的自體免疫效果。在先前的研究中,ZHAO等[22]以NY PRV變異株為基礎,通過同源DNA重組和CRISPR/Cas9基因編輯技術,構建了gE/gI/TK缺失重組PRV病毒(rPRV NY-gE/gI/TK)。rPRV NY- gE /gI/TK毒株在體外生長動力學與親本株NY相似,并被證明對小鼠是安全的,是一種可以表達外源基因的PRV活病毒載體。PRRSV和PRV感染均能引起豬繁殖障礙,而且臨床上常見兩者混合感染。目前,滅活苗和弱毒苗已得到了廣泛應用,并在疾病的預防和控制中發揮了一定作用,但是由于滅活苗的保護力低、免疫效果不穩定、免疫期短,而弱毒苗則有毒力返祖的潛在威脅等缺點,因此研發一種更加安全高效的PRRS和豬PR疫苗,具有現實意義和經濟價值。

本研究利用DNA同源重組和CRISPR/Cas9基因編輯技術,將HP-PRRSV和NADC30-like PRRSV 毒株的GP5基因共同重組至3基因缺失PRV變異毒株中,構建了能夠穩定表達兩種亞型PRRSV 毒株GP5基因的重組病毒rPRV-GP5/HP-GP5/NADC30,為未來開發針對PRRSV流行毒株和PRV變異毒株的疫苗提供了參考,以期能夠對PRRSV和PRV的防控起到更好的作用。