小兒解感顆粒HPLC指紋圖譜及3種成分含量測定研究

董 寵 陳 斌 許 龍 曹 陽 黃順旺 曹明成

小兒解感顆粒（國藥準字Z20080492）是臨床上常用的治療小兒感冒的中藥復方制劑。處方由柴胡、荊芥、桔梗、大青葉、黃芩、甘草組成，具有清熱解表，利咽止咳之功效。主要用于感冒發燒，發熱流涕，咳嗽噴嚏，咽喉腫痛等[1-2]。

指紋圖譜具有整體性、專屬性、可量化等特點，針對復方制劑多成分研究，可最大限度地提取指紋圖譜信息，從而實現對中藥質量的科學、準確評價[3-4]。近年來，就指紋圖譜在中藥的質量控制和評價方面開展了大量研究工作，對評估中藥材質量優劣、真偽及保證其質量的一致性、穩定性具有重要意義，更為保障復方制劑質量提供了一條符合中藥特色的評價方法[5]。本實驗通過探索以簡便的色譜方法、普通的高效液相儀器建立小兒解感顆粒的HPLC指紋圖譜，測定多批次復方制劑中黃芩苷、甘草苷、甘草酸成分的含量[6-7]，以期為完善小兒解感顆粒的質量標準提供參考。

1 儀器與試藥

高效液相色譜儀（LC-20A型）；十萬分之一電子分析天平（AG135 型）、百萬分之一電子分析天平（XP6 型）；超聲波清洗器（KQ-500DB型）。已上市10 批小兒解感顆粒樣品，批號：2002001、2002005、2006002、2009003、2009007、2009008、2010003、2010004、2011001、2011002，由山東明仁福瑞達制藥股份有限公司提供；黃芩苷（批號：110715-201821，含量94.2%：）、甘草酸銨（批號：110731-202021，含量：96.2%）、甘草苷（批號：111610-201908，含量：95.0%）均購自于中國食品藥品檢定研究院；甲醇、乙腈（SIGMA）均為色譜純，實驗用水為超純水(自制)，甲酸及其他試劑均為分析純。

2 方 法

2.1 色譜條件及色譜柱 Agilent 5 HC C18（4.6 mm×250 mm，0.5 μm）；流動相為乙腈（A）-0.1%甲酸溶液（B），梯度洗脫（0～55 min，5%～30%A；55～70 min，30%～45%A；70～80 min，45%～55%A；80～90 min，55%～60%A）；檢測波長為270 nm；流速為1.0 mL·min-1；柱溫為35℃；進樣量為10 μL。

2.2 溶液的制備 ①混合對照品溶液制備：取黃芩苷、甘草苷、甘草酸對照品適量，精密稱定，加甲醇溶解稀釋并定容至刻度，制成每1 mL含黃芩苷100 μg、甘草苷110 μg、甘草酸120 μg的混合對照品溶液，搖勻。②供試品溶液制備：取小兒解感顆粒適量，研細，精密稱取1 g，置具塞錐形瓶中，精密加入80%甲醇25 mL，稱定重量，超聲處理（500 W，40 Khz）30 min，放冷，用80%甲醇補足減失的重量，搖勻，經0.45 μm微孔濾膜濾過，取續濾液作為供試品溶液。

2.3 方法學考察 ①系統適用性試驗：取空白溶液、混合對照品溶液和供試品溶液各10 μL，注入液相色譜儀，進行測定，記錄色譜圖。②精密度考察：精密取同一批次小兒解感顆粒（批號：2009008），按“2.2”內容下的制備過程同法制備供試品溶液，根據“2.1”色譜條件部分完成實驗條件設置并連續檢測6 次，分別計算各共有峰的相對保留時間及相對峰面積的RSD。③重復性考察：精密取同一批次小兒解感顆粒（批號：2009008），照“2.2”內容下的制備過程制備供試品溶液，平行制備6 份，按“2.1”內容下的高效液相色譜條件測定，分別計算各共有峰的相對保留時間及相對峰面積的RSD。④穩定性考察：精密取同一批次對照小兒解感顆粒按“2.2”內容下的制備過程同法制備供試品溶液，按“2.1”內容下的高效液相色譜條件，分別在0、3、6、10、24 h時進樣測定，分別計算各共有峰的相對保留時間及相對峰面積的RSD。

2.4 指紋圖譜的建立及相似度評價 ①10 批樣品指紋圖譜檢測：取10 批已上市小兒解感顆粒，按“2.2”內容下的制備過程依法制備供試品溶液，按“2.1”內容下的高效液相色譜條件分別測定，該樣品所含成分色譜峰于90 min 洗脫完全。將不同批次樣品色譜圖導入中藥指紋圖譜相似度評價系統軟件（國家藥典委員會，2012A）中，通過多點校正后進行色譜峰匹配及相似度分析。②指紋圖譜共有峰的歸屬：按小兒解感顆粒處方和工藝制備單味藥材及各缺味陰性供試品，照“2.2”內容下的制備過程同法制備供試品溶液，按“2.1”內容下的高效液相色譜條件進樣檢測。

2.5 指標性成分含量分析 ①指標峰專屬性考察：根據小兒解感顆粒指紋圖譜峰及甘草苷、黃芩苷、甘草酸對照品色譜峰，確定指紋圖譜中3 種指標性成分色譜峰的位置；另按處方比例分別取缺黃芩、缺甘草藥材適量，加水煎煮提取，經稀釋過濾后作為缺黃芩和缺甘草的陰性對照樣品，按“2.1”項下的色譜條件進樣檢測。②線性關系的考察：取甘草苷、黃芩苷、甘草酸銨對照品適量，精密稱定，加甲醇溶解稀釋并定容至刻度，配制成每1 mL含甘草苷0.41 μg、黃芩苷2.01 μg、甘草酸銨0.15 μg的混合對照品溶液，搖勻，即得。采用逐級稀釋的方式，配制不同濃度的混合對照品溶液，按“2.1”項色譜條件進樣檢測，以峰面積為縱坐標，以濃度（mg/mL）為橫坐標，進行標準曲線的繪制，得到回歸方程和相關系數。③精密度考察：制備一份對照品溶液，根據“2.1”項色譜條件連續檢測6 次，分別計算各峰的峰面積RSD。④重復性考察：取同批次小兒解感顆粒，研細，按照供試品制備方法制備6 份樣品，按“2.1”項色譜條件進樣檢測，得各指標性成分保留時間和含量RSD。⑤穩定性考察：取同一份供試品溶液，分別在0、3、6、10、24 h，按“2.1”項色譜條件進樣檢測，得各指標性成分的峰面積與0 h相比的變化值。⑥加樣回收率考察：稱取6 份已知含量的小兒解感顆粒樣品，精密稱定，分別置具塞錐形瓶中，精密加入各對照品（與小兒解感顆粒中各成分含量相當）適量，按“2.1”項色譜條件進行檢測。⑦含量測定：取10 批次的小兒解感顆粒樣品，按“2.2”項方法制備供試品溶液，“2.1”項下色譜條件進行測定。

3 結 果

3.1 指紋圖譜試驗結果 ①系統適用性試驗結果顯示甘草苷、黃芩苷、甘草酸3 種指標成分的分離度均大于1.5，且理論板數按目標化合物色譜峰計均大于3000。結果見圖1。②精密度：各共有峰的相對保留時間的RSD＜1.0%，相對峰面積的RSD＜3.0%，表明儀器精密度良好。③重復性：各共有色譜峰的相對保留時間RSD＜1.0%，相對峰面積RSD＜3.5%，表明本方法重現性良好。④穩定性：室溫條件下的供試品，分別在0、3、6、10、24 h進行液相檢測，各共有峰的相對保留時間RSD＜1.0%，相對峰面積RSD＜3.0%，表明室溫條件下放置的供試品在24 h內穩定性良好。⑤10 批樣品指紋圖譜檢測：共標識23 個共有峰并生成指紋圖譜及共有模式指紋圖譜。通過與對照品色譜峰保留時間比對，確認了峰9 為甘草苷、峰14 為黃芩苷、峰20 為甘草酸。10 批小兒解感顆粒指紋圖譜各共有峰，以14 號黃芩苷色譜峰為參照峰（S），計算得各共有峰相對保留時間RSD均小于1.0%，相對峰面積RSD為0.00%～50.32%，每批樣品與對照圖譜的相似度為0.999～1.000。⑥指紋圖譜共有峰的歸屬：對小兒解感顆粒物質群中各共有峰進行藥材歸屬分析，物質群中的1 號峰為大青葉、柴胡共有峰；2，3，5，6，8 號色譜峰歸屬于大青葉藥材；峰9、峰20 歸屬于甘草；峰4 為新生成的峰；峰7 歸屬于荊芥；10～19，21～23 號色譜峰歸屬于黃芩藥材。對3 個色譜峰進行了指認，峰9 為甘草苷、峰14 為黃芩苷、峰20 為甘草酸。說明小兒解感顆粒的物質群均可清晰地追溯到藥材，色譜峰歸屬明確。

圖1 空白對照(A)、混合對照品 (B)和小兒解感顆粒供試品溶液(C)的HPLC圖譜

3.2 指標性成分含量測定試驗結果 ①指標峰專屬性考察：陰性供試品色譜在相應的位置上未見相對應的色譜峰，陰性供試品無干擾，專屬性強。②線性關系：甘草苷、黃芩苷、甘草酸在相應線性范圍內，所測對照品溶液的濃度與3 種被測組分峰面積均存在良好的線性關系。其線性關系見表1。③精密度：3 種指標成分的峰面積RSD均小于2.0%，結果表明儀器的精密度良好。④重復性：3 種指標成分的含量RSD值均＜3.0%，表明該方法的重現性良好。⑤穩定性：室溫條件下的供試品，分別在0、3、6、10、24 h進行液相檢測，3 種指標成分的峰面積與0 h相比，峰面積變化值均小于2.5%，表明室溫條件下放置的供試品在24 h內穩定性良好。⑥加樣回收率：3種指標成分的加樣回收率檢測結果顯示，平均加樣回收率均在100.01%～100.78%范圍內，RSD≤3%，結果見表2。⑦樣品含量測定：10 批顆粒含量的測定結果見表3。

表1 指標成分線性回歸方程

表2 甘草苷、黃芩苷、甘草酸加樣回收率結果

表3 小兒解感顆粒中指標成分的含量（n=2，mg/g）

4 討 論

在本研究中，我們結合文獻及實驗對流動相進行篩選，評估甲醇-酸水體系、乙腈-酸水體系，并對比了不同濃度的酸水條件，優選乙腈-0.1%甲酸溶液作為流動相體系完成梯度洗脫，同時結合現行版中國藥典黃芩、甘草藥材項下的指標性成分含量測定最佳吸收波長，采用高效液相DAD檢測器對供試品溶液在不同波長條件下的峰強度、峰數目進行對比，發現波長在270 nm條件下，指紋圖譜出峰數目最多、信號最強。另外，通過對Agilent 5 HC C18等色譜柱的對比，確定Agilent 5 HC C18色譜柱進行樣品測定時，各峰的峰形良好、分離效果較好、圖譜基線穩定。表明采用中藥指紋圖譜技術建立小兒解感顆粒指紋圖譜檢測方法，以一測多評的方法同時測定黃芩苷、甘草苷和甘草酸的含量，供試品處理及檢測方法簡便，可操作性強。

本實驗以飲片-成品顆粒中主要物質群的量值傳遞關系為核心，評價物質群之間的相關性，僅指認甘草苷、黃芩苷、甘草酸3 個色譜峰并進行含量測定，而其他成分指認不足，后期需進一步完善各峰的歸屬，以評價制備工藝的科學性和物質群的批間質量一致性及可追溯性，為完善小兒解感顆粒的質量標準做好基礎工作，確保藥品的安全性、有效性和質量可控性[8-9]。