雄激素對小鼠海馬神經元細胞影響的初步觀察

鄧大同 張雅琪 惠燦燦 王 林

雄激素（androgen）主要指睪酮（testosterone，T）和其在體內的活性代謝產物雙氫睪酮（dihydrotestosterone，DHT）。睪酮由睪丸間質細胞產生的睪酮在腦中能在5α-還原酶的作用下轉化為雙氫睪酮，而雙氫睪酮是一種強效雄激素，其結合雄激素受體的親和力高于睪丸激素[1]。近年來探討雄激素與神經系統疾病的關系逐漸引起了人們的興趣。Zhang KJ等[2]的研究顯示，高水平和低水平的睪酮激素分別提高了人們在地點任務和反應空間任務上的表現。Kusters CDJ等[3]使用孟德爾隨機化分析，得出較高濃度的雄激素與歐洲血統男性的阿爾茲海默?。ˋD）風險降低有關的結果，表明男性中的雄激素可能具有神經保護作用。一項調查70 歲日本老年人唾液睪酮濃度與無癡呆和中風的認知功能相關的橫斷面研究顯示，唾液睪酮濃度與老年男性和女性更好的認知能力呈正相關[4]。這些研究表明雄激素參與了神經元記憶的過程，并在此過程中發揮了重要的作用。為了探究在細胞層面上雄激素對認知功能的影響，本研究對此進行研究，以初步了解雄激素影響認知功能的機制。

1 材料與方法

1.1 實驗細胞 小鼠海馬神經元細胞系（HT22），購買于江蘇省蘇州市海星生物科技有限公司。

1.2 小鼠海馬神經元細胞的培養、傳代 小鼠海馬神經元細胞置于10%胎牛血清（FBS）、100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素的DMEM培養基中培養，置于37 ℃、5% CO2孵育箱中，細胞每2～3 天傳代。傳代3 次后，待細胞生長至90%，用胰蛋白酶消化離心后，加入完全培養基制成細胞懸液（細胞密度約1.5×106cell/mL），以200 uL/孔接種于六孔板（每孔細胞密度約1.5×105cell/mL），24 h后待細胞融合至50%用于實驗。

1.3 試驗分組以及DHT處理小鼠海馬神經元細胞 ①正常對照組：于37 ℃、5% CO2孵育箱中，在10%胎牛血清（FBS）、100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素的DMEM培養基中培養24 h，換液后繼續孵育24 h。②五組不同濃度DHT處理組：于37 ℃、5% CO2孵育箱中，在10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素的DMEM培養基中培養24 h后，棄去舊培養基，加入含不同濃度DHT（處理組1-5 的DHT濃度分別為0.25、0.5、1、2、4 ng/mL）的10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素的DMEM培養基中繼續孵育24 h。以上六組細胞的孵育條件一致，均種于六孔板上。重復三次。

1.4 細胞計數方法 細胞計數板：使用磷酸鹽緩沖液將樣品稀釋至細胞數不高于1×106個/mL；將臺盼藍溶液與細胞懸液按體積比1∶1 混合計數；臺盼藍溶液可以滲透入死細胞細胞膜，從而分別活細胞與死細胞，只計入活細胞數；樣品吹打均勻后取10 μL加入細胞計數板，每個樣品設置3個重復，取平均數。

1.5 統計學分析 應用SPSS 17.0 統計軟件分析數據。符合正態分布的計量資料以表示，多組間比較采用單因素方差分析。P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 小鼠海馬神經元細胞形態學觀察 通過倒置相差顯微鏡依次各組海馬神經元細胞，主要觀察海馬神經元細胞的大體形態，細胞之間的聯系，同時比較各組細胞的形態學變化。剛接種的海馬神經元細胞懸浮于培養液中，呈圓形。培養12 h后，海馬神經元細胞小部分已開始貼壁生長，形態為三角形或扁平形，大多數還是處于無觸角的圓形狀態。培養24 h觀察細胞已基本全部貼壁，貼壁后形態呈三角形、梭形不規則多邊形，胞核大而圓，位置居中。加入含有不同濃度DHT的10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素的DMEM培養基后，培養24 h后，對照組（a）細胞生長迅速，相互重疊，細胞編織狀排布，連接密集，生長密度約為100%；處理組1（b）細胞呈編織狀排列，重疊較少，連接密集，生長密度約為80%；處理組2（c）細胞較為緊密，編織成網，部分細胞未聯結，生長密度約為70%；處理組3（d）細胞大部分編織狀連接，可見較多懸浮球形死細胞，生長密度約為70%；處理組4（e）細胞大部分互相連接，懸浮球狀死細胞較處理組3 稍少，生長密度約為70%；處理組5（f）可見少數連接的細胞，部分細胞梭形，大部分為三角形和圓形，生長密度約為50%。見圖1。

圖1 海馬神經元細胞在倒置相差顯微鏡下的形態

2.2 不同濃度DHT對小鼠海馬神經元細胞生長密度影響觀察 如圖2 所示，經過不同濃度的DHT處理培養24 h后，小鼠海馬神經元細胞的生長密度變化分別是80%-70%-70%-70%-50%，隨著DHT濃度升高，小鼠海馬神經細胞生長似乎呈現下降趨勢。見圖2。

圖2 細胞生長密度曲線

2.3 不同濃度DHT對小鼠海馬神經元細胞數的影響 通過表1 可見，在DHT 0.25～4 ng/mL的濃度范圍內，與對照組相比，不同濃度的DHT處理組對于小鼠海馬神經元細胞的生長密度存在顯著差異（P＜0.05）。

表1 不同濃度DHT對小鼠海馬神經元細胞數的影響（）

表1 不同濃度DHT對小鼠海馬神經元細胞數的影響（）

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3 討 論

中樞神經系統的正常生長、分化、生理和衰老的過程都受到機體內性腺激素的影響。越來越多的證據支持雄激素在大腦發育和大腦衰老過程中作為神經保護劑或神經調節劑的生物學基礎，以及雄激素在涉及認知功能、情緒障礙和性沖動中的重要性。

雄激素和認知功能的影響受到廣泛關注。多項中老年男性的流行病學研究表明，睪酮濃度越低，認知能力下降和癡呆的患病率和發病率越高[5-6]。老年前列腺癌患者在去勢治療后，癡呆癥和阿爾茲海默病的發生風險增加[7]。然而，雄激素對認知功能的作用機制尚未完全闡明，可能與β-淀粉樣蛋白的沉積、海馬神經元損傷、突觸可塑性改變等有關[8]。在動物實驗中，Yan XS等[9]研究結果顯示，睪酮治療能夠顯著增加阿爾茨海默病大鼠模型Morris水迷宮實驗的逃避潛伏期和路徑長度。其研究通過向雙側側腦室注射β1-42低聚淀粉樣蛋白以誘導建立雄性大鼠認知功能障礙模型，繼而皮下注射0.75 mg睪酮，尼氏染色、免疫組織化學、western blot和酶聯免疫吸附實驗結果顯示，睪酮治療后大鼠海馬錐體細胞數量、海馬CA1區樹突棘密度、海馬突觸后密度蛋白95（PSD-95）的免疫應答及表達水平、超氧化物歧化酶和谷胱甘肽過氧化物酶活性均有不同程度的升高。并且，雄激素受體拮抗劑氟他胺能夠抑制睪酮對阿爾茨海默病大鼠模型認知能力的保護作用。表明睪酮對認知功能和PSD-95表達水平的影響是通過特異性雄激素受體介導的，睪酮能夠通過增加海馬神經元數量和增強突觸可塑性來改善AD模型大鼠的認知功能障礙。與動物實驗相比，細胞實驗的干擾因素較少，影響因素相對容易控制，郭國新等人采用原代培養的海馬神經元細胞為研究對象，觀察睪酮在短時間內對神經元樹突棘密度的變化，發現睪酮可通過非基因組途徑促進海馬神經元的樹突棘增長[10]。

體外細胞實驗作為一種理想的研究模型，相比動物實驗具有諸多優勢，以細胞做為研究對象，去除了復雜的活體內環境影響，能夠精確影響因素。本實驗采用原代培養的海馬神經元為研究對象，觀察不同濃度DHT處理小鼠海馬神經元細胞24 h后引起的細胞形態學與生長密度的改變，觀察到隨著雙氫睪酮濃度增加到一定濃度，海馬細胞生長速度有減慢趨勢，這一結果與上述試驗結果并不完全一致，DHT起到了抑制小鼠海馬神經元細胞增長的作用，可能是由于體內雙氫睪酮主要來源于睪酮在外周的代謝產物，其可通過基因組與非基因組途徑分別作用于細胞核及胞漿內受體，而本實驗的體外因素較為單一，后續課題組將進一步研究其變化規律及作用機制。

本課題初步觀察了雄激素對小鼠海馬神經元細胞影響，對于雄激素對認知功能的具體作用機制有待進一步探索。