抗幽門螺桿菌四聯(lián)療法臨床療效和治療前后腸道菌群變化

喬華雙 毛玉娣 陳琦琦 吳星辰 丁西平

幽門螺桿菌（Hp）是一種革蘭氏陰性、微需氧、螺旋形和有鞭毛的細(xì)菌，在全球范圍內(nèi)約一半人口被它感染[1]。Hp感染導(dǎo)致多種胃腸道并發(fā)癥，如慢性胃炎、消化性潰瘍，甚至胃癌及胃黏膜相關(guān)淋巴組織淋巴瘤等疾病，因此該類細(xì)菌被納入Ⅰ類致癌物[2]。腸道菌群在腸道內(nèi)形成了一個復(fù)雜、動態(tài)變化且空間異質(zhì)的生態(tài)系統(tǒng)，通過能量代謝、物質(zhì)產(chǎn)生、免疫反應(yīng)等方面維持腸道內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)，并影響疾病的轉(zhuǎn)歸[3]。本研究通過16SrDNA高通量測序比較抗Hp治療過程中菌群變化和抗Hp治療成功組與失敗組之間的菌群差異，尋找導(dǎo)致根除失敗的菌群。找出可能影響療效的腸道菌群改變，為益生菌聯(lián)合療法提高Hp根除率提供臨床依據(jù)，同時也為抗幽門螺桿菌治療探索新的方案提供方向。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2021年12月-2022年4月在安徽省立醫(yī)院就診的幽門螺桿菌感染患者作為研究對象，本研究經(jīng)安徽省立醫(yī)院的倫理委員會審查同意且患者知情同意。①納入標(biāo)準(zhǔn)：年齡18～65歲；呼氣試驗陽性患者；有明顯消化道癥狀患者；既往無根除Hp治療史。②排除標(biāo)準(zhǔn)：近1個月有抗生素、鉍劑、PPI、益生元、益生菌及抗腹瀉藥物治療史；對PPI、抗生素及鉍劑過敏患者；患者患有嚴(yán)重肝腎疾病，以及其它影響腸道菌群構(gòu)成的疾?。恢委熂坝^察期間服用其它影響腸道菌群藥物者；妊娠期、哺乳期婦女及患有嚴(yán)重精神疾病者。本研究共納入符合標(biāo)準(zhǔn)的患者22例，年齡21～65歲，男性13例，女性9例。臨床表現(xiàn)主要有腹痛9例，惡心8例，反酸9例，腹脹12例，噯氣6例，腹瀉3例，食欲不振4例，便秘1例，無無癥狀感染者。

1.2 方法

1.2.1 臨床資料收集 收集符合標(biāo)準(zhǔn)患者的年齡、性別及臨床表現(xiàn)，并記錄患者服藥過程中不良反應(yīng)及服藥后臨床癥狀改善情況?；颊叻盟幬锘拘畔⒓白⒁馐马椧姳?。

表1 患者服用藥物基本信息及注意事項

1.2.2 16SrDNA測序方法 收集患者治療前、治療2 周及停藥1 個月后的大便標(biāo)本1～3 g于糞便盒中，2 h內(nèi)送至-80°冰箱進行儲存。對微生物組樣本，選用合適的總DNA提取方法，采用Nanodrop對DNA進行定量，并通過1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA提取質(zhì)量。以微生物核糖體RNA或特定基因片段等目標(biāo)序列為靶點，對rRNA基因可變區(qū)進行PCR擴增，采用Illumina公司的TruSeq Nano DNA LT Library Prep Kit制備測序文庫，使用MiSeq測序儀進行雙端測序，測序長度為200～450 bp。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS25.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行分析，正態(tài)分布計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，計數(shù)資料用n（%）表示，兩組之間比較采用t檢驗，多組之間采用F檢驗；非正態(tài)分布計量資料以中位數(shù)和四分位數(shù)表示，兩組之間比較采用Mann-Whitney U檢驗，多組之間采用Kruskal-Wallis檢驗，P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 治療效果及治療過程中患者臨床癥狀改變情況分析 治療成功18 例，治療失敗4 例，幽門螺桿菌根除率81.82%?；颊咴谥委熯^程中均規(guī)律服藥，無漏服、停藥及合并其它用藥情況?；颊咴谥委熀笈R床癥狀較前改善，主要表現(xiàn)為惡心、反酸、腹痛腹脹及食欲不振癥狀較前改善。

2.2 腸道菌群α多樣性變化 根據(jù)16SrDNA測序結(jié)果，使用Chao1 指數(shù)、Simpson指數(shù)、Shannon指數(shù)來分析幽門螺桿菌感染患者治療前后腸道菌群α多樣性變化，治療前、治療2 周、停藥1 個月后α多樣性指數(shù)差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），比較治療成功組與治療失敗組在停藥1 個月后的腸道菌群，發(fā)現(xiàn)治療成功組與失敗組α多樣性指數(shù)差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見表2。

表2 兩組不同治療時間α多樣性指數(shù)比較

2.3 腸道菌群顯著性差異分析 根據(jù)16SrDNA測序結(jié)果，幽門螺桿菌感染患者腸道菌群優(yōu)勢菌門主要為厚壁菌門、擬桿菌門、變形菌門、放線菌門。幽門螺桿菌根除治療過程中，厚壁菌門、變形菌門、放線菌門、糖細(xì)菌門、梭桿菌門序列數(shù)發(fā)生改變，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見表3。幽門螺桿菌感染患者優(yōu)勢菌屬主要有擬桿菌屬、布勞特氏菌屬、糞桿菌屬、瘤胃球菌屬。幽門螺桿菌根除治療過程中，布勞特氏菌屬、志賀菌屬、糞桿菌屬、普雷沃菌屬、顫螺菌屬、梭菌屬序列數(shù)發(fā)生改變，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見表4。

表3 治療過程中腸道菌群在門水平差異性比較

2.4 治療成功組與失敗組菌群差異分析 根據(jù)16SrDNA測序結(jié)果，比較治療成功組與治療失敗組在停藥1 個月后的腸道菌群，發(fā)現(xiàn)兩組門水平治療差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見表5，與治療成功組相比，治療失敗組多爾氏菌屬（Dorea）序列數(shù)升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（Z=-2.457，P=0.014），治療失敗組雙歧桿菌屬序列數(shù)降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（Z=-2.533，P=0.011），見表6。

表6 兩組在屬水平差異性比較

3 討 論

幽門螺桿菌是一種革蘭陰性細(xì)菌，Hp利用其運動性、趨化性、尿素酶產(chǎn)生和其他機制來適應(yīng)管腔的酸性條件，并在上皮細(xì)胞表面狹窄處定植。由于Hp感染會導(dǎo)致胃內(nèi)微環(huán)境改變，并且通過其產(chǎn)生的毒力因子等對胃黏膜上皮細(xì)胞造成損傷，繼而導(dǎo)致胃內(nèi)炎癥甚至癌癥，在Hp感染早期，根除治療是預(yù)防疾病發(fā)生的有效措施[4]。Hp定植在胃黏膜上皮細(xì)胞，可以引起胃內(nèi)pH改變及導(dǎo)致胃黏膜上皮損傷，Hp通過改變胃內(nèi)pH、內(nèi)分泌及免疫功能調(diào)節(jié)進而影響下游腸道菌群改變。

本研究患者在治療2周及停藥1個月腸道菌群的α多樣性均降低，表明在抗幽門螺桿菌藥物治療過程中導(dǎo)致腸道內(nèi)物種多樣性下降，腸道內(nèi)物種多樣性下降會繼而導(dǎo)致腸道內(nèi)菌群紊亂。而治療成功組與治療失敗組在α多樣性無顯著性差異（P＞0.05），說明不同治療效果對菌群多樣性的影響并不明顯。治療過程中志賀菌屬等菌屬序列數(shù)升高，而糞桿菌屬、普雷沃菌屬、顫螺菌屬等產(chǎn)生短鏈脂肪酸的優(yōu)勢菌屬序列數(shù)降低，這些菌群的豐度發(fā)生改變，會導(dǎo)致菌群紊亂。志賀菌屬是一種促炎細(xì)菌，可產(chǎn)生LPS，刺激炎癥因子的分泌[5]。在抗Hp治療過程中，產(chǎn)生短鏈脂肪酸的菌屬序列數(shù)在治療過程中較前減低，可能導(dǎo)致腸道黏膜屏障受損和腸道炎癥。SCFA，尤其是丁酸，是維持結(jié)腸上皮細(xì)胞的重要底物，丁酸是結(jié)腸細(xì)胞利用的首選燃料，體內(nèi)丁酸螯合的主要部位是腸上皮細(xì)胞。緊密連接蛋白本身調(diào)節(jié)管腔和肝門系統(tǒng)之間的細(xì)胞內(nèi)分子高速公路。在結(jié)腸中產(chǎn)生的SCFA中，丁酸鹽是緊密連接蛋白最重要的調(diào)節(jié)劑，蛋白質(zhì)是緊密連接組件的關(guān)鍵組成部分，并且已被證明可以通過增加claudin-1 和Zonula Occludens-1（ZO-1）的表達和occludin再分布來增強腸屏障功能。細(xì)菌脂多糖增加會觸發(fā)免疫細(xì)胞（單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和庫普弗細(xì)胞）中的Toll樣受體4（TLR4）介導(dǎo)的促炎級聯(lián)反應(yīng)，丁酸被證實可以抑制炎癥反應(yīng)[6]。丁酸可通過抑制幽門螺桿菌的生存能力和毒力來減少幽門螺桿菌誘導(dǎo)的炎癥，并可能減少與幽門螺桿菌感染小鼠腸道微生物群相關(guān)的炎癥[7]。本研究發(fā)現(xiàn)，抗幽門螺桿菌治療過程中，腸道內(nèi)優(yōu)勢菌屬和多樣性發(fā)生改變，導(dǎo)致致病菌生長和產(chǎn)生短鏈脂肪酸菌屬減少，腸道屏障作用減弱及炎癥水平升高，因此在根除幽門螺桿菌治療過程中需要關(guān)注腸道菌群紊亂問題，腸道菌群發(fā)生紊亂后，腸道內(nèi)的穩(wěn)態(tài)受到破壞，可能導(dǎo)致機會性感染，因此我們在抗幽門螺桿菌治療過程中需要關(guān)注腸道菌群紊亂，并及時做出應(yīng)對之策。

本研究中根據(jù)16SrDNA測序結(jié)果，比較治療成功組與治療失敗組在停藥1 個月后的腸道菌群，與治療成功組相比，治療失敗組多爾氏菌（Dorea）屬序列數(shù)升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），治療失敗組雙歧桿菌屬序列數(shù)降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。多爾氏菌屬豐度高的患者腸道炎癥反應(yīng)更重，容易出現(xiàn)腸道黏膜的損傷，這類腸道致病菌的過度生長，可能會導(dǎo)致根除治療的失敗。雙歧桿菌是一種革蘭氏陽性厭氧菌，容易通過附著在腸道上形成菌落，對胃腸道環(huán)境有抵抗力，它在腸道菌群中生存時會產(chǎn)生各種抗菌肽。雙歧桿菌主要作用是提高抗炎細(xì)胞因子水平，降低促炎細(xì)胞因子水平。使用雙歧桿菌后，測乙酸、丙酸、丁酸和總短鏈脂肪酸含量均顯著提高，改變了腸道菌群的組成，腸道菌群的豐度和多樣性較前升高[8]。本研究中治療失敗組雙歧桿菌序列數(shù)較成功組降低，說明雙歧桿菌序列數(shù)降低，產(chǎn)生短鏈脂肪酸相對減少，導(dǎo)致腸道通透性升高和炎癥水平升高，可能最終導(dǎo)致抗幽門螺桿菌治療失敗。益生菌可以改善腸道微生物平衡，通過預(yù)防或減輕腸道感染、癌癥、過敏性疾病和心血管疾病對宿主發(fā)揮有益作用。并且可以促進腸道成熟和完整性，抵御病原體并調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)[9]。本研究中治療失敗組雙歧桿菌菌屬序列數(shù)較治療成功組低，雙歧桿菌的豐度減低導(dǎo)致短鏈脂肪酸的減少，腸道屏障作用減少，促炎因子增多，炎癥水平升高，最終可能導(dǎo)致治療失敗。為益生菌聯(lián)合療法提高治療根除率提供臨床依據(jù)，同時也為抗幽門螺桿菌治療探索新的方案提供方向。

綜上所述，本研究中發(fā)現(xiàn)在抗幽門螺桿菌治療過程患者的腸道菌群優(yōu)勢菌群發(fā)生改變，導(dǎo)致腸道菌群紊亂。治療成功組與失敗組之間的菌群差異，表現(xiàn)為致病菌的序列數(shù)增加和產(chǎn)生短鏈脂肪酸菌群的序列數(shù)降低，導(dǎo)致腸道屏障作用減弱，促炎因子增多，炎癥水平升高，最終可能影響根除效果，導(dǎo)致根除治療失敗。因此在治療過程中需要關(guān)注腸道菌群紊亂，為益生菌聯(lián)合療法提高Hp根除率提供臨床依據(jù)。