可的松慢性暴露對雌性斑馬魚的生殖毒性

耿雨欣，吳雅詩，黃曼林，侯麗萍

（廣州大學生命科學學院，廣東 廣州 510006）

內分泌干擾物（Endocrine disruption chemical，EDCs）屬于一種存在于自然環境中的、具有類激素效果的化學物質，它會對生命體內源激素的合成、分泌、轉運和降解過程產生影響，從而對生命體的生殖發育、免疫、內分泌和神經系統造成損害，并可造成其后多代的內分泌代謝失調[1]。EDCs 主要來源于工農業生產和民眾日常生活產生的廢氣、廢水和廢渣。大量文獻表明，當前全球主要水體中均已含有多種EDCs。由于水體的流動性較強，EDCs 可以隨水體流動進行長距離的擴散污染。因此，EDCs對水生動物的暴露毒理效應已經成為備受關注的全球性環境問題[2]。不同于常見的已知有毒化合物如殺蟲劑、雙酚A、二噁英等，天然和人工合成的5大類類固醇激素（糖皮質激素、鹽皮質激素、雌激素、雄激素與孕激素）被發現是一類新型EDCs 且活性較強[3-4]。與雌激素和雄激素類物質的生態毒理學效應研究報道[5-7]相比，有關環境糖皮質激素的生態毒理學研究報道相對較少。

糖皮質激素作為一種類固醇激素，是由下丘腦—垂體—腎上腺軸調控，并由腎上腺皮質束狀帶分泌，其在生物體內是由糖皮質激素受體（Glucocorticoid receptor，GR）介導，隨后發揮多種生物學功能。糖皮質激素以其抗炎癥和免疫抑制作用在人類臨床和獸醫臨床上應用廣泛[8]。

由于污水處理不充分或直接排放，導致工廠廢水、畜牧場排水和地表水等水體環境中含有不同濃度的糖皮質激素，從幾十ng/L 到幾百ng/L 范圍不等[3-4]。研究表明，魚類暴露于外源性糖皮質激素環境下，其生理生化和遺傳過程均可能受到不良影響。例如，除了改變葡萄糖穩態以外，糖皮質激素還會影響免疫系統（如白細胞計數的減少和免疫抑制）和內分泌系統（如雄激素效應）[9]。Willi 等[10-11]研究表明，可的松或丙酸氯倍他索的生理效應主要包括使斑馬魚胚胎心率增加，減少其自發性肌肉收縮，并加速其孵化等；而地塞米松則被發現可使斑馬魚心臟體積增大，心肌細胞變大，心臟性能增強。盡管脊椎動物的生殖是由下丘腦—垂體—性腺軸來控制的，但糖皮質激素在機體生殖過程中也發揮著重要作用[12]。這可以由糖皮質激素受體和雌激素受體之間的某些相互作用來證明。例如：糖皮質激素受體的激活阻止了雌二醇對雌激素受體表達的正向調節作用[13]，糖皮質激素和雌激素受體在鱒魚大腦和垂體中的分布重疊[14]，皮質類固醇和性類固醇之間可能存在拮抗作用[15]，性類固醇調節皮質類固醇的產生，這些結果都進一步支持糖皮質激素受體和雌激素受體在生殖周期中存在相互作用這一論斷。由此推斷，皮質類固醇可能直接或間接參與卵母細胞成熟的控制，糖皮質激素和雌激素的代謝途徑之間可能存在潛在干擾。因此，利用可的松評價糖皮質激素對雌性斑馬魚生殖損傷的毒理風險具有重要的現實指導意義。

除了探究糖皮質激素對親代的毒性效應以外，學者們還發現EDCs 對其子代也可能造成不利影響，即化合物的跨代毒性效應。特別是當親代接受暴露后無明顯表型改變時，化合物對子代得影響可能更容易被忽視[16]。成年雌性斑馬魚暴露于低濃度的氟氫可的松21 d 后，其機體免疫應答和大腦晝夜節律相關基因的差異性表達顯著，子一代幼魚的孵化率、心跳和游動行為都在6 和42 ng/L 的氟氫可的松暴露下顯著增加[17]。Ma 等[18]探究了環境中雄激素1,4-雄烯二酮（ADD）和雄烯二酮（AED）對斑馬魚的跨代效應，將受精后21～144 d 的F0代斑馬魚分別暴露于0～500 ng/L 的ADD 和AED 中，其F1代在清水中培養0～144 d，結果發現：在F0代中，ADD 和AED 均顯著增加了雌魚的數量，表現雌激素效應；在F1代中，高濃度（393 ng/L）ADD 組的雌魚仍然顯著多于雄魚，占比為63.5%，而高濃度（428 ng/L）AED 組的雄魚顯著多于雌魚，占比為78.7%。

為了探究可的松對雌性斑馬魚生殖系統是否具有毒性效應和跨代效應，研究以雌性斑馬魚及其子一代為研究對象，從形態學、病理組織學、行為學等方面評估糖皮質激素可的松的毒理風險。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

斑馬魚購于廣州花鳥市場，魚齡120 d 左右。水質監測采用Thermo 多道水質監測儀（Thermo Orion，520M-01，廣州）。

主要試劑有可的松（CAS 53-06-5，上海安譜實驗科技股份有限公司）、二甲基亞砜[DMSO，CAS 67-68-5，生工生物工程（上海）股份有限公司]、Bouin' s 固定液（飛凈生物科技有限公司）。暴露試劑以DMSO 為助溶劑，配制成1 g/L 的母液，再依次稀釋到相應濃度，4℃避光保存。

主要設備有體式顯微鏡及成像系統（Leica MC170 HD，新加坡）、高清攝像頭（RERVISION RER-BXH2MP 0550，中國）以及動物軌跡跟蹤系統（EthoVision XT，荷蘭）。養殖容器為方形玻璃缸（25 cm×20 cm×20 cm）。

1.2 試驗方法

將斑馬魚在實驗室條件下穩定飼養2 周且無死亡狀況出現后再用于慢性毒理試驗，期間控制飼養水體環境的硬度、pH 值、溶解氧含量、溫度、光周期等參數，穩定飼養和暴露期間采用自然光源，每日喂食2 次。

可的松暴露濃度分別為5、50、500 ng/L，以等體積的DMSO 為對照，共4 個處理，設置3 個平行，每個容器10 尾健康活潑的雌性斑馬魚（肉眼分辨），共120 尾斑馬魚。試驗期間保證24 h 換一次水。暴露周期持續60 d。

暴露結束后，在交配產卵前夜選擇發育良好、游動活躍的F0代魚，挑出雌魚和雄魚以1 ∶2 的比例置于有隔板的產卵缸內進行交配試驗（每缸中5條雌魚，每暴露組共15 條）。第二日早上8：00 抽開隔板，30 min 后收集魚卵。將產卵缸中的魚卵收集到準備好的培養皿中并統計產卵數和孵化率。

每缸中挑選5 尾雌魚于冰水混合物上暈眩并解剖，為了避免晝夜節律造成的試驗差異，采用多人合作模式，保證在2 h 內解剖完60 尾。解剖前稱量體重，解剖后稱量性腺重量，并計算性腺指數（GSI= 性腺重/魚體重量）。

1.3 檢測指標及方法

1.3.1 斑馬魚卵巢組織形態學觀察解剖時將新鮮的雌魚性腺組織置于Bouin's 固定液中，取固定24 h 后的性腺組織用酒精脫水，用二甲苯透明，石蠟包埋，切片，H&E 染色，中性樹膠封片，最后在Olympus BX-51 顯微鏡下觀察并拍照。

1.3.2 幼魚發育形態學觀察對子一代胚胎進行培養，分別在產卵后24、48、72、120、144 h 使用體視顯微鏡觀察斑馬魚胚胎有無畸變發育，拍照記錄。

1.3.3 幼魚行為學測定受精后144 h 時選擇形態正常的幼魚記錄其活動。將單條魚（n=7）放置在圓形玻璃皿（半徑為2 cm）中，在27±1℃的黑暗環境下觀察 6 min，使用動物軌跡跟蹤系統記錄幼魚的基本運動情況。

1.4 數據處理

使用IBM SPSS Statistics 26 統計分析軟件分析試驗數據，并進行單因素方差分析（one-way ANOVA）、差異顯著性分析及t檢驗。試驗數據以“平均值±標準差（Mean±SD）”表示。

2 結果與分析

2.1 可的松對親代成年雌魚性腺的毒性作用

由圖1 可知，成年雌性斑馬魚卵巢中的卵泡發育包括核仁外周卵母細胞（PO）、皮質肺泡卵母細胞（CO）、早期卵黃卵母細胞（EV）、晚期-成熟卵黃卵母細胞（LV）等4 個階段。對照組可觀察到典型的成年雌魚性腺切片，即主要由EV 和LV 占據的性腺切片（圖1a）。通過比較不同處理各發育階段卵母細胞的細胞數量百分比（圖2）發現，與對照相比，5、50 和500 ng/L 可的松暴露處理的核仁外周卵母細胞（PO）比例分別上升了205.26%、341.92%和379.36%，差異極顯著（P＜0.001）；對照組中幾乎不可見皮質肺泡卵母細胞（CO，比例僅為0.03%），而5、50 和500 ng/L 處理組中CO 比例相對上升了13.77、10.78 和10.41 個百分點（P＜0.001）；EV 與LV 為發育更為成熟的卵母細胞，二者的細胞頻率處于下降趨勢，雖然EV 在可的松暴露組中的比例下降不具有統計學意義，但是LV 在50 和500 ng/L 可的松暴露組的比例分別比對照下降了88.62%和90.88%，差異顯著（P＜0.05）。總體來看，可的松暴露顯著提高了早期發育階段卵母細胞的比例，同時高濃度暴露處理的晚期-成熟卵黃卵母細胞（LV）數量顯著減少。這表明高濃度的可的松暴露會抑制卵母細胞發育。從圖3 可以看出，各組成年雌性斑馬魚的GSI 指數和性腺重量未出現顯著變化。

圖1 成年雌性斑馬魚在不同濃度可的松中暴露60 d 后卵巢典型組織切片

圖2 暴露可的松60 d 后斑馬魚卵巢不同發育階段卵母細胞數量百分比變化

圖3 成魚性腺GSI（a）和性腺重量（b）

2.2 可的松對子一代胚胎早期發育的毒性效應

從表1 可以看出，高濃度（500 ng/L）暴露組的雌魚無法產卵，而中濃度（50 ng/L）暴露組的產卵量比對照組少88.16%，孵化率也比對照組低67.51 個百分點，差異均達極顯著水平（P＜0.001）；而低濃度（5 ng/L）暴露組的產卵量下降41.30%（P＜0.01），孵化率則降低6.71 個百分點，差異也達極顯著水平（P＜0.01）。由此可見，暴露于可的松的成年雌性斑馬魚產卵量與孵化率隨暴露濃度升高而降低，具有濃度依賴性。

表1 不同暴露濃度下產卵量和孵化率

從幼魚行為測試熱圖（圖4a）可以看出，5 ng/L可的松暴露組的子一代幼魚活動明顯增加，對其移動距離和移動速度的統計（圖4b）也可以看出這一點，5 ng/L 可的松暴露組的移動距離和移動速度分別比對照組分別增加了455.28%和803.87%，差異極顯著（P＜0.001）；50 ng/L 處理組的子一代幼魚游動速度為60.92 cm/s，比對照組提升了504.37% （P＜0.001）。行為測試結果表明可的松暴露使得子一代幼魚更加興奮。由圖5 可知，5～50 ng/L 可的松暴露下，斑馬魚子一代沒有出現明顯的畸變現象。

圖4 不同處理幼魚游動能力的比較

圖5 胚胎發育形態學觀察

3 結論與討論

在脊椎動物中糖皮質激素作為一種甾體激素能直接作用于性腺，導致下丘腦—垂體—性腺軸功能被抑制，從而抑制性腺甾體激素的合成、延遲青春期的發育，干擾正常的卵巢周期和排卵[19]。該研究中高濃度可的松暴露后卵巢中PO 頻率大幅升高，而EV 和LV 的頻率下降，說明可的松慢性暴露能夠抑制卵泡發育。除此之外，可的松慢性暴露成年雌性斑馬魚導致生殖損傷還表現為減少產卵數量，具體表現為產卵數量隨暴露濃度升高而顯著減少，并且經過高濃度（500 ng/L）暴露的雌性斑馬魚不能產卵。Lalone 等[20]的研究也表明，500 ng/L 的地塞米松暴露成年雌性黑頭呆魚21 d 后可降低成年雌魚的產卵量。皮質醇被發現可體外抑制鱒魚卵泡中性類固醇的分泌[21]。以上結果均表明糖皮質激素暴露對成年雌性斑馬魚具有生殖毒性。該研究中，5～50 ng/L可的松處理處理對孵化出的子一代形態學尚未產生明顯的毒理效應，但行為分析中可以觀察到明顯的游動速度加快。在Willi 等[10]的研究中也得到這樣的結果，胚胎分別暴露于丙酸氯倍他索、皮質醇和可的松下時，前兩者胚胎出現明顯肌肉收縮減少、心率以及孵化速度加快的現象，而可的松暴露組未出現類似現象，這可能是由于藥物的生物學活性不同所致。該試驗初步探究了環境濃度的可的松對雌性斑馬魚的生殖毒性作用和跨代效應，為深入研究可的松對斑馬魚生殖毒理機制提供了數據支持，后續可進一步研究可的松對斑馬魚性腺軸基因表達和相關通路的影響。