長(zhǎng)枝木霉聚合根腫菌多元RNAi 靶標(biāo)防治榨菜根腫病的研究

劉 穎，蔡兆明，王殿東

（長(zhǎng)江師范學(xué)院現(xiàn)代農(nóng)業(yè)與生物工程學(xué)院，重慶 涪陵區(qū) 408100）

榨菜（Brassica juncea）又名莖瘤芥，是一種重要的十字花科蔬菜作物，廣泛栽培于中國(guó)南部地區(qū)，具有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值[1]。根腫病是榨菜栽培中的主要病害，對(duì)其產(chǎn)量和品質(zhì)造成極大影響[2]。根腫病是由蕓薹根腫病菌（Plasmodiophora brassicae）引起的一種土傳性病害，主要危害十字花科作物，植株染病后根部首先出現(xiàn)病斑，隨后根部腫大和腐爛，嚴(yán)重時(shí)會(huì)造成組織腐爛，植株死亡[3-6]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，全球已有60 多個(gè)國(guó)家受到根腫病的影響，一旦染病通常會(huì)造成10%～15%的產(chǎn)量損失[7-9]，尤其是對(duì)榨菜產(chǎn)量的影響較大，嚴(yán)重時(shí)可造成36%以上的損失[8]。目前，根腫病的防治方法主要包括農(nóng)業(yè)防治[10]、化學(xué)防治[11]和生物防治[12]。農(nóng)業(yè)防治只能在一定程度上預(yù)防或緩解根腫病的癥狀，但是無(wú)法達(dá)到根治的目的；化學(xué)防治是現(xiàn)在運(yùn)用最為普遍、效果也最好的防治方法，但是長(zhǎng)期施藥會(huì)給農(nóng)產(chǎn)品安全以及生態(tài)環(huán)境帶來(lái)一定風(fēng)險(xiǎn)；生物防治對(duì)農(nóng)產(chǎn)品和環(huán)境均較安全，是現(xiàn)階段防治根腫病的研究熱點(diǎn)[13]。

MAPKs 是一類絲裂原活化蛋白激酶，MAPK基因在細(xì)胞的生長(zhǎng)和繁殖中十分重要，根腫菌中的MAPK基因在根腫菌對(duì)植物進(jìn)行表層侵染的時(shí)候起作用[14-16]。小干擾RNA（Small interfering RNA，siRNA）又稱短干擾RNA（short interfering RNA）或沉默RNA（silencing RNA），是一個(gè)長(zhǎng)20 到25個(gè)核苷酸的雙股RNA，在生物學(xué)上有許多不同的用途。目前，已知siRNA 主要參與RNA 干擾（RNAi）現(xiàn)象，以帶有專一性的方式調(diào)節(jié)基因的表達(dá)，是一種常用的遺傳學(xué)研究手段[17]。通過(guò)siRNA 技術(shù)對(duì)MAPK基因進(jìn)行靶向沉默，從而干擾MAPK 信號(hào)通路，在植物抗病研究中取得了顯著的成果[18]。王鵬程[19]通過(guò)沉默擬南芥（Arabidopsis thaliana）中MAPK2基因發(fā)現(xiàn)，突變體植株生長(zhǎng)更加旺盛，并表現(xiàn)出與野生型不同的形態(tài)特征，例如蓮座葉增多、或分層，花芽萌發(fā)時(shí)缺乏頂端優(yōu)勢(shì)，次級(jí)花序生長(zhǎng)增強(qiáng)等。這些差異可能暗示了MAPK2 在發(fā)育過(guò)程中的作用，同時(shí)也預(yù)示著這種差異與生長(zhǎng)素的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的關(guān)系。然而，關(guān)于MAPK基因在根腫病發(fā)病過(guò)程中的作用報(bào)道較少。該研究旨在通過(guò)RNAi 技術(shù)對(duì)生防菌長(zhǎng)枝木霉的MAPK1、MAPK2、MAPK3基因進(jìn)行沉默，以研究MAPK基因在榨菜根腫病防治過(guò)程中的作用。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試生防菌為長(zhǎng)枝木霉，供試蕓薹根腫菌采自重慶涪陵榨菜種植地，保存于長(zhǎng)江師范學(xué)院榨菜病蟲害防治實(shí)驗(yàn)室，供試種子為涪雜2 號(hào)榨菜種子。

1.2 構(gòu)建表達(dá)載體

從發(fā)病榨菜腫根中提取根腫菌孢子，提取總RNA 反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以cDNA 為模板分別以MAPK1-360F/MAPK1-673R、MAPK2-776F/MAPK2-1126、MAPK3-560F/MAPK3- 885R 為引物擴(kuò)增根腫菌MAPK1、MAPK2、MAPK3基因的cDNA 片段后，以MAPK1、MAPK2基因片段為模板，以MAPK1-360F、MAPK1-JR、MAPK2-JR、MAPK2-1126R 為引物擴(kuò)增MAPK1和MAPK2基因融合片段，以MAPK1-360F、MAPK2-JR 、MAPK3-JF、MAPK3-885R 為引物，以MAPK1和MAPK2基因融合片段和MAPK3基因片段為模板擴(kuò)增MAPK1、MAPK2、MAPK3基因融合片段；以融合片段為模板，分別以引物MAPK1-Hind3-360F/MAPK3-Xba1- 885R 和MAPK1-Bgl2-360F/MAPK3-Spe1-885R 擴(kuò)增含有酶切位點(diǎn)的正向序列和反向序列，在HindⅢ、XbaI酶切位點(diǎn)處加入正向片段，在BglⅡ、SpeI酶切位點(diǎn)處加入反向片段到載體pDH-RH 上，構(gòu)建pDH-RHMAPK 載體（圖1）。所用引物序列如表1 所示，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

表1 載體構(gòu)建所用引物序列

圖1 絲狀真菌pDH-RH-MAPK 載體示意圖

1.3 pDH-RH-MAPK 載體轉(zhuǎn)化長(zhǎng)枝木霉

供試生防菌長(zhǎng)枝木霉首先采用液體培養(yǎng)獲得菌絲。收集菌絲用0.7 mol/L 的氯化鈉溶液沖洗至團(tuán)狀，按1 g 菌絲加入20 mg 崩潰酶（20 mg/mL）的量向菌絲中加入崩潰酶，在28℃、150 r/min 的條件下酶解6 h，然后用0.7 mol/L 氯化鈉溶液反復(fù)沖洗后收集原生質(zhì)體，再用5 mL STC 溶液（1.2 mol/L 山梨醇，50 mmol/L 氯化鈣，10 mmol/L Tris-HCl）重懸。采用PEG 介導(dǎo)的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化方法進(jìn)行轉(zhuǎn)化，用含有60 mg/L 潮霉素B 的PDA 培養(yǎng)基篩選陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子。

1.4 轉(zhuǎn)基因菌株鑒定

經(jīng)潮霉素B 篩選后，提取陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子（即轉(zhuǎn)基因的長(zhǎng)枝木霉菌）的基因組DNA，以未轉(zhuǎn)化的長(zhǎng)枝木霉菌基因組DNA 和ddH2O 為對(duì)照，以潮霉素引物（Hyg-F：5'- AAGCCTGAACTCACCGCGAC-3'；Hyg-R：5'- CTATTCCTTTGCCCTCGGAC-3'）進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，檢測(cè)是否轉(zhuǎn)化成功。

1.5 轉(zhuǎn)基因長(zhǎng)枝木霉菌對(duì)根腫病防效分析

將轉(zhuǎn)基因的長(zhǎng)枝木霉菌配置成濃度為1×107個(gè)/mL的懸浮液，取30 mL 轉(zhuǎn)基因長(zhǎng)枝木霉菌懸液浸根處理榨菜幼苗30 min，然后將幼苗移栽至含有根腫菌的土壤（含8×107個(gè)根腫菌）中，以無(wú)菌水和未轉(zhuǎn)基因長(zhǎng)枝木霉菌為對(duì)照，接種后40 d 取樣，測(cè)量根鮮重，并統(tǒng)計(jì)發(fā)病株數(shù)及發(fā)病情況。根腫病病害分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)如下：0 級(jí)，根部無(wú)腫瘤；1 級(jí)，僅側(cè)根有小腫瘤；2 級(jí)，側(cè)根有大腫瘤，主根有小腫瘤；3 級(jí)，主根有大腫瘤。每個(gè)處理調(diào)查20株，計(jì)算發(fā)病率和病情指數(shù)。

發(fā)病率（%）=（發(fā)病株數(shù)/總株數(shù)）×100

病情指數(shù)=[(各級(jí)病株數(shù)×相對(duì)病級(jí)數(shù)值)/(調(diào)查總株數(shù)×最高病級(jí)數(shù)值)]×100

1.6 轉(zhuǎn)基因長(zhǎng)枝木霉菌處理后根腫菌中靶標(biāo)基因表達(dá)分析

收集轉(zhuǎn)基因長(zhǎng)枝木霉菌、未轉(zhuǎn)基因長(zhǎng)枝木霉菌和無(wú)菌水處理40 d 后的根腫菌（來(lái)自于發(fā)病的榨菜腫根），提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以根腫菌Actin2基因?yàn)閮?nèi)參進(jìn)行熒光定量PCR（qRT-PCR），檢測(cè)根腫菌中MAPK1、MAPK2、MAPK3基因的表達(dá)量，qRT-PCR 的引物序列見表2，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

表2 qRT-PCR 的引物序列

2 結(jié)果與分析

2.1 融合MAPK1、MAPK2、MAPK3 基因的dsRNA 表達(dá)載體構(gòu)建

PCR 擴(kuò)增后分別得到根腫菌MAPK1、MAPK2、MAPK3基因的cDNA 片段，大小分別為314、351、326 bp（圖2A），與預(yù)測(cè)大小一致，測(cè)序后基因組序列也一致，可用于后續(xù)試驗(yàn)。隨后按照1.2 中的步驟依次將3 個(gè)基因融合，其中，MAPK1和MAPK2基因的融合片段大小為660 bp（圖2B），與預(yù)測(cè)大小一致；3 個(gè)基因的融合片段大小為1 000 bp 左右（圖2C），符合連接片段對(duì)應(yīng)大小。

圖2 3 個(gè)MAPK 基因克隆及融合片段的電泳檢測(cè)結(jié)果

將根腫菌MAPK1、MAPK2、MAPK3基因融合片段分別在HindⅢ、XbaI和BglⅡ、SpeI酶切位點(diǎn)處正向和反向連接到絲狀真菌dsRNA 表達(dá)載體上，構(gòu)建木霉菌表達(dá)MAPK1、MAPK2、MAPK3基因融合片段的 dsRNA 載體，結(jié)果如圖3 所示。

圖3 pDH-RH-MAPK 載體正向連接和反向連接的酶切電泳檢測(cè)結(jié)果

2.2 pDH-RH-MAPK 載體轉(zhuǎn)化長(zhǎng)枝木霉的結(jié)果

利用原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法，將表達(dá)根腫菌3 個(gè)MAPK基因的dsRNA 載體轉(zhuǎn)化到長(zhǎng)枝木霉菌株，挑取陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子，利用潮霉素抗性基因引物進(jìn)行菌落PCR 鑒定，獲得陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子（圖4）。利用根腫菌中MAPK1、MAPK2、MAPK3基因特異引物檢測(cè)3 個(gè)基因片段在轉(zhuǎn)基因長(zhǎng)枝木霉中的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)3個(gè)基因的RNA 均在長(zhǎng)枝木霉中進(jìn)行表達(dá)（圖5）。

圖4 潮霉素抗性引物 PCR 檢測(cè)結(jié)果

圖5 熒光定量PCR 檢測(cè)3 個(gè)MAPK 基因在轉(zhuǎn)基因長(zhǎng)枝木霉中的表達(dá)情況

2.3 轉(zhuǎn)基因長(zhǎng)枝木霉對(duì)根腫菌MAPK 基因表達(dá)水平的影響

采集接種轉(zhuǎn)基因長(zhǎng)枝木霉菌和對(duì)照處理的榨菜根腫病樣本，分離根腫菌并提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，通過(guò)熒光定量PCR 檢測(cè)靶標(biāo)基因MAPK1、MAPK2、MAPK3基因表達(dá)量，結(jié)果如圖6 所示，轉(zhuǎn)基因長(zhǎng)枝木霉菌處理榨菜后可顯著降低根腫菌中MAPK1、MAPK2、MAPK3基因的表達(dá)量。

圖6 各處理根腫菌MAPK 基因的表達(dá)情況

2.4 接種轉(zhuǎn)基因長(zhǎng)枝木霉后對(duì)榨菜根腫病的防效

由圖7 可知，各處理榨菜根腫病發(fā)病率為100%，其中空白對(duì)照組（CK）的平均鮮重為 1.37 g，病情指數(shù)為 62；接種未轉(zhuǎn)基因長(zhǎng)枝木霉處理（MM-CK）的平均鮮重為 1.30 g，病情指數(shù)為 63；接種轉(zhuǎn)基因長(zhǎng)枝木霉處理（MM-MAPK）的平均鮮重為 1.17 g，病情指數(shù)為 55，MM-MAPK 處理的榨菜根鮮重和病情指數(shù)均顯著低于CK 和MM-CK 處理，而MM-CK處理的榨菜根鮮重顯著低于CK，但病情指數(shù)與CK無(wú)顯著差異。

圖7 各處理榨菜發(fā)病腫根的平均根鮮重和病情指數(shù)

3 結(jié)論與討論

根腫病是十字花科蔬菜栽培中危害最為嚴(yán)重的病害，榨菜不同于其他十字花科蔬菜，其本身是野生四倍體，這給抗病育種帶來(lái)了極大的障礙。該研究所采用的長(zhǎng)枝木霉分離自榨菜根腫病發(fā)病田，是一株對(duì)根腫病具有生防作用的菌株。通過(guò)RNAi 技術(shù)對(duì)該長(zhǎng)枝木霉菌株中多個(gè)MAPK基因進(jìn)行聯(lián)合干擾，可增強(qiáng)長(zhǎng)枝木霉對(duì)根腫病病原菌的抗性，顯著抑制根腫菌中3 個(gè)MAPK基因的表達(dá)，從而提高長(zhǎng)枝木霉對(duì)榨菜根腫病的防效，降低榨菜根腫病的病情指數(shù)。MAPK 蛋白通路是病原菌和植物發(fā)育和致病過(guò)程中極為重要的信號(hào)通路，參與了多種生物學(xué)過(guò)程，包括細(xì)胞分裂、生長(zhǎng)發(fā)育、應(yīng)對(duì)生物和非生物脅迫等，在植物對(duì)病原體侵染和逆境脅迫的響應(yīng)中發(fā)揮了重要作用[20-22]。該研究中采取的長(zhǎng)枝木霉聚合siRNA 策略可以同時(shí)靶向多個(gè)MAPK基因，從而達(dá)到更好的防治效果。同時(shí)，采用生防菌防治病害的這種手段專一性強(qiáng)、效率高、整體危害較輕，可有效減輕根腫菌對(duì)榨菜產(chǎn)業(yè)的危害。