CoxA16感染兒童手足口病患者IL-6、IFN-α水平變化及其與TLR9基因多態性的相關性*

羅 筱,白寶鑫,王 爽△

(1.十堰市婦幼保健院檢驗科,湖北十堰 442000;2.湖北醫藥學院,湖北十堰 442000)

手足口病是一類腸道病毒感染引起的傳染性疾病,兒童是該病的易感人群,引發手足口病的腸道病毒有多種(型),其中以腸道病毒71型和柯薩奇病毒A16型(CoxA16)最為常見。隨著近幾年腸道病毒71型滅活疫苗的接種,腸道病毒71型感染的兒童手足口病占比減少。雖然CoxA16感染后大部分患兒臨床癥狀較輕,但發病率較高,引起越來越多的關注[1-2]。CoxA16感染的患兒臨床表現輕重不一,輕癥者僅為發熱、皮疹、口腔黏膜散在皰疹等,重癥者可出現中樞神經系統損害、心肺功能不全等[3-6],CoxA16感染的發病機制至今沒有完全闡明,可能與其感染導致的異常免疫反應有關[7-8]。機體的非特異性免疫系統在抗感染過程中發揮重要功能,其通過模式識別受體識別具有病原體相關分子模式(PAMP),快速啟動機體的免疫反應從而抵抗病原微生物的進一步感染[9-11]。Toll樣受體(TLR)是模式識別受體的一種,TLR具有單個的跨膜的蛋白,可識別來源于微生物的具有保守結構的PAMP分子,是參與非特異性免疫的一類重要蛋白質分子,也是連接非特異性免疫和特異性免疫的橋梁[12-13]。有研究認為,TLR基因多態性與多種病毒的免疫激活過程密切相關,并對患者病情預后有一定的影響[14-16]。作為TLR家族成員之一的TLR9近年來受到研究者的廣泛關注,TLR9基因多態性與CoxA16易感性、患兒病情預后之間的關聯尚不明確。本研究旨在探討CoxA16感染兒童手足口病患者外周血白細胞介素-6(IL-6)、α干擾素(IFN-α)水平及其與TLR9基因多態性的相關性,為CoxA16手足口病的診療提供新的思路,現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2018年4月至2021年10月十堰市婦幼保健院收治的201例CoxA16感染的兒童手足口病患兒作為觀察組,選取同期132例健康兒童作為對照組。納入標準:(1)患兒肛拭子標本CoxA16核酸檢測為陽性,診斷參照2018年版《手足口病診療指南》[17]。(2)入院前患兒無藥物治療史。排除標準:(1)患兒合并其他的病毒感染所致疾病。(2)患兒有自身免疫缺陷癥疾病或先天性疾病。根據患兒是否出現中樞神經系統并發癥,將觀察組分為輕癥組(無中樞神經系統并發癥,158例)和重癥組(有中樞神經系統并發癥,43例)。3組一般資料比較,差異無統計學意義(P>0.05),具有可比性,見表1。本研究通過醫院倫理委員會審查,所有患兒家屬均簽署知情同意書。

表1 3組一般資料比較

1.2 方法

1.2.1試劑及材料

IL-6、IFN-α檢測試劑盒、DNA提取試劑盒購自上海碧云天生物技術有限公司,TLR9檢測試劑盒購自上海安為生物科技有限公司,PCR試劑盒購自購自寶生物工程(大連) 有限公司。低溫離心機購自美國Thermo Scientific公司,PCR儀、凝膠成像儀購自美國Bio-Rad公司,DYY-6C電泳儀購自北京六一儀器廠。引物設計及合成購自上海生工生物工程公司。

1.2.2標本采集及處理

于患兒入院24 h內采集外周血3 mL于乙二胺四乙酸二鉀(EDTA-K2)真空抗凝管,混勻,3 000 r/min離心10 min,分離血漿和細胞,-80 ℃低溫冰箱保存備用。

1.2.3IL-6、IFN-α水平測定

采用ELISA測定血漿IL-6、IFN-α水平,測定方法嚴格按照試劑盒說明書進行操作。

1.2.4TLR9基因多態性檢測

按照試劑盒說明進行操作,快速抽提全血基因組DNA,NanoDrop分光光度計檢測提取標本的吸光度(A)值,A260/A280介于1.6～1.8,將提取的標本DNA于-80 ℃低溫冰箱保存,采用限制性片段長度多態性聚合酶鏈反應(PCR-RELP)技術檢測TLR9基因多態性,上下游引物見表2。PCR擴增條件:95 ℃預變性5 min,95 ℃變性30 s,58 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s,循環30次,72 ℃延伸5 min。PCR擴增產物用限制性內切酶酶進行酶切,酶切產物在2%瓊脂糖凝膠上電泳,然后通過Bio-Rad凝膠成像系統觀察結果,判斷標本的基因型。

表2 引物序列

1.3 統計學處理

2 結 果

2.1 各組IL-6、IFN-α、TLR9表達水平比較

輕癥組、重癥組IL-6、IFN-α、TLR9表達水平高于對照組,且重癥組高于輕癥組(P<0.05),見表3。

表3 各組IL-6、IFN-α、TLR9表達水平比較

2.2 TLR9基因Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗及分布頻率的比較

TLR9基因rs352140、rs164640、rs187084位點多態性的預期基因型頻率均處于Hardy-Weinberg平衡(P>0.05);各組rs352140、rs164640位點的基因型和等位基因分布比較,差異無統計學意義(P>0.05),但rs187084位點基因型和等位基因分布比較,差異有統計學意義(P<0.05),其中對照組及輕癥組手足口病患兒的C等位基因分布率明顯低于重癥組(P<0.05),見表4。TLR9基因rs187084位點PCR-RFLP電泳圖譜,見圖1。

Lane1:TC基因型(356、209、147 bp);Lane2、4:TT基因型(209、147 bp);Lane3、5:CC基因型(356 bp)。圖1 TLR9基因rs187084位點PCR-RFLP電泳圖譜

表4 各組TLR9基因Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗及分布頻率的比較

2.3 二元logistic回歸分析TLR9基因rs187084位點基因型與兒童手足口病的相關性

TLR9基因rs187084位點CC/TC基因型、C等位基因是兒童手足口病CoxA16感染的危險因素(P<0.05),見表5。

表5 logistic回歸分析TLR9基因rs187084位點與CoxA16型手足口病的關系(n)

3 討 論

CoxA16感染主要引起兒童手足口病,CoxA16感染后大部分患兒臨床癥狀較輕,但有小部分患兒可能會出現嚴重的中樞神經系統和心肺功能病變而轉變成重型患兒,進而威脅生命安全。目前CoxA16感染的發病機制至今沒有完全闡明,有學者認為,可能與CoxA16感染后導致的異常免疫反應和免疫損傷有關[15-16]。有研究表明,TLR9途徑可觸發核因子κB(NF-κB)信號通路的活化,進而釋放炎癥介質如IL-6、IFN-α等[17-18],IL-6、IFN-α是重要的炎癥介質,二者與感染密切相關,其表達情況受基因水平、轉錄水平及轉錄后水平的調控[19],但國內外關于TLR9與手足口病的相關性研究較少,因此,本研究旨在探討CoxA16感染的手足口病患兒外周血IL-6、IFN-α水平及其與TLR9基因多態性的相關性,為CoxA16手足口病的診療提供新的思路。

本研究選取201例符合納入標準的CoxA16手足口病患兒進行分析,研究結果顯示,重癥組、輕癥組IL-6、IFN-α、TLR9表達水平高于對照組,且重癥組高于輕癥組,差異有統計學意義(P<0.05),表明在CoxA16感染過程中,炎癥反應在手足口病的進展中發揮著重要的影響,IL-6、IFN-α、TLR9可能是CoxA16感染由輕癥進展成重癥的關鍵因子。通過進一步研究TLR9基因rs352140、rs164640、rs187084位點多態性,發現TLR9基因rs352140、rs164640位點基因型分布及等位基因分布比較,差異無統計學意義(P>0.05),而rs187084基因位點基因型及T、C等位基因分布比較,差異有統計學意義(P<0.05),且對照組及輕癥組手足口病患兒的C等位基因分布率明顯低于重癥組。進一步用二元logistic回歸統計分析,結果表明rs187084位點CC基因型是兒童手足口病CoxA16感染的危險因素,CC基因型人群是TT基因型人群患病風險的2.552倍,是TT+TC基因型人群患病風險1.824倍,表明TLR9基因rs187084位點基因多態性與CoxA16型手足口病存在較大關聯。但本研究納入的病例數較少,且并未進行多因素的分層分析,后續還有待增加樣本量,探討不同因素對TLR9基因多態性與CoxA16感染手足口病相關性的影響。

綜上所述,CoxA16型手足口病患兒IL-6、IFN-α、TLR9表達水平升高,TLR9基因rs187084位點基因多態性與CoxA16型手足口病存在較大關聯,并可能是CoxA16感染由輕癥進展成重癥的關鍵因子。