LRG1通過CCR1促進類風濕性關節炎滑膜成纖維細胞激活的機制研究*

龐琳烜,謝榮華,李治琴,杜望磊,丁 進△

(1.空軍軍醫大學西京醫院臨床免疫科,西安 710032;2.咸陽市第一人民醫院風濕科,陜西咸陽 712000)

類風濕性關節炎(rheumatoid arthritis,RA)是一種以侵蝕性關節炎為主要臨床表現的自身免疫性疾病[1]。流行病學數據顯示,我國RA發病率為0.42%,病程5～10年時致殘率高達43%[2]。隨著病程延長,RA致殘率逐漸升高,嚴重影響患者的生活質量。由于發病機制不清、病因不明,目前尚沒有RA的特效治療方法。RA主要病理表現為滑膜組織增生和血管翳形成,并逐漸出現關節軟骨和骨破壞,最終導致關節畸形和功能喪失。因而,明確滑膜增生和血管翳形成的機制將為RA的治療提供依據。

富亮氨酸重復糖蛋白1(leucine-rich alpha-2-glycoprotein-1,LRG1)是富亮氨酸重復蛋白家族的一員,含有8個富亮氨酸重復結構域。LRG1廣泛參與蛋白質-蛋白質相互作用、信號轉導及細胞黏附[3]。LRG1不僅作為跨膜蛋白高表達于神經系統,并參與突觸的生長、形成及神經遞質的轉移和釋放[4],也可作為部分腫瘤或炎癥性疾病的診斷標志物[5-6]。研究表明,RA患者血清LRG1水平明顯高于骨關節炎患者,且血清 LRG1水平與 RA疾病活動度呈正相關[7-8],說明LRG1可能參與RA的疾病進程。但LRG1是否可以調控滑膜增生和血管翳形成及其可能的機制尚不清楚。趨化因子受體1(chemokine receptor 1,CCR1)是一種A類G蛋白偶聯受體,可介導其相應的配體控制細胞定向遷移。而滑膜干細胞池中間充質干細胞向滑膜組織遷移是滑膜增生的原因之一。研究表明,CCR1在RA患者單核細胞中明顯升高[9]。CCR1拮抗劑可減輕兔椎間盤退變模型中椎間盤炎癥[10]。基于此,本文研究了LRG1調控成纖維樣滑膜細胞增殖、遷移、侵襲及影響血管內皮細胞血管生成能力的機制,以及CCR1在其中發揮的作用,以期為RA的治療提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實驗細胞

成纖維樣滑膜細胞株MH7A細胞購自廣州吉妮歐生物科技有限公司。人臍靜脈內皮細胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)購自武漢普諾賽生命科技有限公司。

1.1.2主要試劑

Lipfectamin3000購自美國Invitrogen公司。細胞計數試劑盒8(CCK-8)、二喹啉甲酸(BCA)蛋白濃度測定試劑盒購自上海碧云天生物技術有限公司。PrimeScriptTM逆轉錄試劑盒(去基因組)購自寶日醫生物技術(北京)有限公司。Matrigel膠購自美國Corning公司。 LRG1兔多克隆抗體(PA5-118035)、CCR1兔多克隆抗體(PA5-112058)購自美國Invitrogen公司。LRG1干擾小RNA(siRNA)及其陰性對照siRNA(NC siRNA)、pcDNA3.1-CCR1及其陰性對照(pcDNA3.1空載質粒Vector)由上海吉凱基因醫學科技股份有限公司提供。

1.2 方法

1.2.1細胞培養

MH7A細胞和HUVECs均培養于含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和0.1 mg/mL鏈霉素的DMEM培養基中,置于5% CO2、37 ℃恒溫培養箱中培養。

1.2.2細胞因子處理

取對數生長期的MH7A細胞接種于6孔板中(2×106個/孔),待其融合率至80%時,分別加入1、5、10、20 ng/mL的腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor α,TNF-α)刺激MH7A細胞24 h。

1.2.3細胞轉染及分組

取對數生長期的MH7A細胞(2×105個/mL)接種于6孔板。待其融合率至70%～90%時,棄去原培養基,饑餓過夜,次日進行轉染。實驗分組如下:對照組(細胞不做處理)、TNF-α組(細胞給予10 ng/mL的TNF-α處理24 h)、NC siRNA組(細胞轉染NC siRNA 24 h后,給予20 ng/mL的TNF-α處理24 h)、LRG1 siRNA組(細胞轉染LRG1 siRNA#1或LRG1 siRNA#2 24 h后,給予20 ng/mL的TNF-α處理24 h)、LRG1 siRNA+Vector組(細胞共轉染LRG1 siRNA#1和pcDNA3.1載體24 h,給予TNF-α處理24 h)和LRG1 siRNA+CCR1組(細胞共轉染LRG1 siRNA#1和pcDNA3.1-CCR1 24 h,給予TNF-α處理24 h)。根據Lipfectamin3000說明書,125 μL減血清(Opti-MEM)培養基稀釋7.5 μL Lipfectamin3000試劑(記為A液);250 μL Opti-MEM培養基稀釋5 μg/μL LRG1 siRNA工作液(或5 μg/μL LRG1 siRNA和5 μg/μL pcDNA3.1-CCR1)和10 μL P3000試劑(記為B液);125 μL A液與125 μL B液混合后即為轉染復合物。每孔加入250 μL轉染復合物,轉染24 h后給予20 ng/mL的TNF-α處理24 h。轉染48 h提取細胞總蛋白,通過Western blot驗證轉染效率。LRG1 siRNA序列如下:正義鏈5′-GGG AAA CCA GCU GAA GUU U-3′,反義鏈3′-CCC UUU GGU CGA CUU CAA A-3′。

1.2.4CCK-8測定細胞活力

取對數生長期的MH7A細胞接種于6孔板,經轉染LRG1 siRNA質粒(或LRG1 siRNA質粒和pcDNA3.1-CCR1質粒)24 h后,消化細胞并將細胞接種于96孔板中(5×104個/mL,每孔100 μL),于37 ℃條件下培養。24 h后每孔加入10 μL CCK-8溶液孵育4 h。使用酶標儀測量450 nm處的吸光度(A450)值。

1.2.5實時熒光定量逆轉錄PCR(qRT-PCR)檢測LRG1和CCR1 mRNA表達水平

取對數生長期的MH7A細胞接種于6孔板,經轉染LRG1 siRNA質粒(或LRG1 siRNA質粒和pcDNA3.1-CCR1質粒)24 h后給予20 ng/mL的TNF-α處理24 h。TRIzol試劑提取總RNA。用RNA逆轉錄試劑盒將RNA逆轉錄為互補DNA(cDNA),qRT-PCR檢測LRG1和CCR1 mRNA的表達水平。以β-actin為內參,使用 2-ΔΔCT計算目的基因表達的相對變化值。LRG引物序列如下:正向5′-TGC TCA CCC TTG ACC TTA GC-3′,反向5′-TAG GTA GCG CAG TTT TGG CT-3′。CCR1引物序列如下:正向5′-AGA CTT CAC GGA CAA AGT CC-3′,反向5′-TGA TCA CAC TTG TCA CCA CC-3′。

1.2.6Western blot檢測LRG1和CCR1表達水平

取對數生長期的MH7A細胞接種于6孔板,經轉染LRG1 siRNA質粒(或LRG1 siRNA質粒和pcDNA3.1-CCR1質粒)24 h后給予20 ng/mL的TNF-α處理24 h。每孔加入放射免疫沉淀法(RIPA)裂解液冰上裂解20 min,BCA法測定細胞蛋白質濃度。取20 μg蛋白于10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)膠分離,轉移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜。5%脫脂奶粉室溫封閉1 h后,加入LRG1兔多克隆抗體(1∶1 500稀釋)和CCR1兔多克隆抗體(1∶1 000稀釋),4 ℃孵育過夜。磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌后,加入辣根過氧化物酶(HRP)標記的羊抗兔IgG抗體(1∶2 000稀釋)室溫孵育1 h,隨后增強化學發光液處理顯示免疫印跡條帶,采用ImageJ軟件分析各條帶的灰度值。

1.2.7Transwell實驗檢測細胞侵襲

Matrigel預處理Transwell上室。然后將轉染LRG1 siRNA質粒(或LRG1 siRNA質粒和pcDNA3.1-CCR1質粒)24 h后的細胞用含1%胎牛血清的DMEM培養基培養,并接種于Transwell上室(1×105個/mL,每孔200 μL),Transwell下室為含10%胎牛血清的DMEM培養基。上室加入100 μL TNF-α(10 ng/mL),37 ℃、5% CO2環境下培養24 h。用棉簽輕輕刮去上室中未侵襲的細胞,4%多聚甲醛固定細胞,0.1%結晶紫染色10 min,顯微鏡下觀察侵襲細胞數。

1.2.8血管形成實驗觀察細胞生長狀態及小管形成情況

Matrigel基質膠涂抹48孔板,每孔200 μL。按照1.2.3細胞分組方法處理MH7A細胞,然后分別用對照組、TNF-α組、NC siRNA組、LRG1 siRNA組收集到的條件培養基(200 μL)重懸HUVECs(2×104個/mL)。37 ℃、5% CO2培養箱培養6 h。倒置顯微鏡觀察細胞生長狀態及小管形成情況。

1.2.9免疫共沉淀實驗(co-immunoprecipitation,Co-IP)

Co-IP檢測LRG1與CCR1相互作用。用含蛋白酶抑制劑Aprotinin(終濃度為1 μL/mL)的非變性裂解液NETN處理MH7A細胞,冰上靜置裂解30 min后,12 000 r/ min離心10 min,收集上清液;實驗分為3組:Input組、LGR1組和IgG組。其中20 μL上清液加入2×上樣緩沖液煮5 min,作為Input組;剩余上清液加入LRG1兔多克隆抗體(2 μL,IgG抗體作為對照),4 ℃孵育過夜,隨后加入80 μL的G蛋白-瓊脂糖凝珠,4 ℃孵育過夜。離心棄上清液后,加入600 μL NETN裂解液,顛倒混勻。洗滌3次后在沉淀中加入20 μL 2×上樣緩沖液煮5 min。Western blot檢測LRG1和CCR1表達水平。

1.3 統計學處理

2 結 果

2.1 LRG1在TNF-α處理的MH7A細胞中表達升高

與對照組比較,隨著TNF-α濃度的升高,MH7A中LRG1 mRNA和蛋白相對表達水平均逐漸升高,見圖1;與20 ng/mL TNF-α處理相比,40 ng/mL TNF-α處理MH7A細胞后,LRG1 mRNA及蛋白相對表達水平無明顯差異,因此后續選用20 ng/mL TNF-α進行實驗。

A:qRT-PCR檢測TNF-α處理后LRG1 mRNA相對表達水平;B、C:Western blot檢測TNF-α處理后LRG1相對表達水平;a:P<0.05,與對照組比較。圖1 TNF-α處理上調MH7A細胞中LRG1表達水平

2.2 沉默LRG1降低MH7A細胞增殖、遷移和侵襲能力

Western blot實驗表明,LRG1敲低后,MH7A細胞中LRG1相對表達水平明顯降低,且LRG1 siRNA#1相比LRG1 siRNA#2敲低效率更高(圖2A),因此將LRG1 siRNA#1用于后續實驗。CCK-8實驗表明,TNF-α處理后MH7A細胞活力明顯升高;與NC siRNA組相比,LRG1 siRNA組細胞活力明顯下降[(137±15)%vs.(228±24)%,P<0.05],見圖2B。劃痕實驗和侵襲實驗表明,與對照組相比,TNF-α組細胞遷移率升高,細胞侵襲能力增加;與NC siRNA組相比,LRG1 siRNA組細胞遷移率明顯降低,侵襲細胞數明顯減少[(56.0±6.7)個vs.(102.0±7.9)個,P<0.05],見圖2C～E。

A:Western blot檢測LRG1敲低效率;B:CCK-8實驗檢測細胞活力;C:劃痕實驗檢測細胞遷移能力;D、E:Transwell侵襲實驗檢測細胞侵襲能力;a:P<0.05,與對照組比較; b:P<0.05,與NC siRNA組比較;①:對照組;②:TNF-α組;③:NC siRNA組;④LRG1 siRNA組。圖2 沉默LRG1降低MH7A細胞增殖、遷移和侵襲能力

2.3 LRG1敲除降低HUVECs血管生成能力

用LRG1敲除的MH7A細胞培養基處理HUVECs以觀察HUVECs血管生成情況。結果表明,與NC siRNA組相比,LRG1敲除后(LRG1 siRNA組)HUVECs的血管形成能力明顯降低,見圖3。

圖3 不同條件處理的MH7A細胞培養基對HUVECs血管生成能力的影響

2.4 LRG1與CCR1相互作用

TNF-α組CCR1 mRNA及蛋白相對表達水平分別是對照組的2.6倍和2.0倍,差異均有統計學意義(P<0.05);與NC siRNA組相比,LRG1 siRNA組CCR1 mRNA(1.74±0.19vs.2.55±0.26)及蛋白(1.27±0.05vs.1.87±0.16)相對表達水平均明顯降低,見圖4A～C。Co-IP結果表明,在LRG1的免疫沉淀復合物中,檢測到CCR1的存在,表明LRG1可與CCR1相互作用,見圖4D。

A:qRT-PCR檢測LRG1敲低后CCR1 mRNA相對表達水平;B、C:Western blot檢測LRG1敲低后CCR1相對表達水平;D:Co-IP檢測LRG1與CCR1相互作用;a:P<0.05,與對照組比較; b:P<0.05,與NC siRNA組比較;①:對照組;②:TNF-α組;③:NC siRNA組;④LRG1 siRNA組。圖4 LRG調控CCR1表達并與CCR1相互作用

2.5 過表達CCR1抑制LRG1對MH7A細胞增殖、遷移和侵襲的影響

將LRG1 siRNA和pcDNA3.1-CCR1共轉染至MH7A細胞中,然后檢測細胞增殖、遷移和侵襲能力。Western blot結果表明,敲低LRG1并過表達CCR1后(LRG1 siRNA+CCR1組)CCR1表達水平明顯升高(圖5A)。與單獨敲低LRG1(LRG1 siRNA+Vector組)相比,敲低LRG1并過表達CCR1后,MH7A細胞活力[(260±23)%vs.(95±6)%,P<0.05]、細胞遷移率明顯升高,侵襲細胞數明顯增加[(60.5±5.8)個vs.(87.6±7.4)個],見圖5B～E。

A:Western blot檢測CCR1過表達后CCR1相對表達水平;B:CCK-8實驗檢測細胞活力;C:劃痕實驗檢測細胞遷移能力;D、E:Transwell侵襲實驗檢測細胞侵襲能力;a:P<0.05,與LRG1 siRNA+Vector組比較;①:LRG1 siRNA組;②:LRG1 siRNA+Vector組;③:LRG1 siRNA+CCR1組。圖5 過表達CCR1抑制LRG1對MH7A細胞增殖、遷移和侵襲的影響

3 討 論

本研究表明,沉默LRG1可降低MH7A細胞增殖、遷移和侵襲能力,并降低HUVECs血管生成能力。機制研究表明,LRG1可與CCR1相互作用,并通過調控CCR1調節MH7A細胞行為。研究表明,RA患者血清LRG1水平明顯高于骨關節炎患者,且血清LRG水平與RA疾病活動度呈正相關[7-8];在托珠單抗治療期間,LRG比C反應蛋白或基質金屬蛋白酶3作為RA疾病活動生物標志物的效能更高[11],說明LRG1可能參與RA的疾病進程。HE等[12]研究發現,LRG1可通過血管內皮生長因子促進胃癌細胞的增殖和血管生成能力。在心力衰竭小鼠模型中,LRG1通過與轉化生長因子-β1(transforming growth factor β1,TGF-β1)競爭受體結合抑制心臟成纖維細胞的激活[13]。本研究發現,TNF-α處理MH7A細胞后,LRG1水平升高,且沉默LRG1可降低MH7A細胞增殖、遷移和侵襲能力。血管翳由滑膜中新生血管、滑膜細胞、炎癥細胞等構成,具有類似腫瘤組織的特性,其生成是RA一個顯著的病理特征。新生血管與正常血管結構上有很多不同之處,如生長迅速、結構紊亂、缺乏肌層致血管壁薄而脆等。研究表明,LRG1可通過激活TGF-β通路調控糖尿病腎病、膽管癌、非小細胞肺癌等多種疾病異常血管的形成[14-16]。抑制 LRG1可提高內皮細胞覆蓋率并改善血管功能[17]。另一方面,白細胞介素-6(interleukin 6,IL-6)通過促進信號轉導及轉錄激活因子3(signal transduction and activator of transcription 3,STAT3)與LRG1啟動子結合來激活LRG1轉錄,并促進血管生成;而敲除LRG1后,IL-6不能刺激血管生成[18]。這些發現提示LRG1可參與調控血管形成。本研究發現,沉默LRG1可抑制HUVECs血管生成。

除了血管翳形成,滑膜增生是RA的另一種主要病理表現形式。滑膜增生可能有兩種原因:(1)成纖維樣滑膜細胞數量增多;(2)滑膜干細胞池中間充質干細胞向滑膜組織遷移并分化。本研究表明,沉默LRG1可抑制MH7A細胞的遷移和侵襲能力。這與LRG1在骨關節炎中的功能相似,即LRG1可促進骨關節炎軟骨下骨中的血管生成和間充質干細胞遷移[19]。通過查閱文獻發現,LRG1可能與CCR1相互作用[20]。CCR1可吸引循環單核細胞向發炎的滑膜遷移[21]。同時,CCR1可促進間充質干細胞歸巢并向損傷組織的遷移[22]。本研究發現,沉默LRG1可明顯降低CCR1 mRNA及蛋白表達水平。通過Co-IP本研究證實了LRG1與CCR1的相互作用,并發現過表達CCR1可逆轉LRG1沉默對MH7A細胞增殖、遷移和侵襲能力的抑制作用。因此,作者推測LRG1有可能通過調控CCR1表達影響滑膜組織中間充質干細胞向炎癥部位的遷移,導致滑膜增生。但是LRG1是直接還是間接與CCR1結合還需進一步實驗驗證。

綜上所述,沉默LRG1可下調CCR1從而抑制MH7A細胞的增殖、遷移、侵襲和HUVECs細胞血管生成能力,為LRG1作為RA治療靶標提供了理論依據。