LINC00626下調miR-18a和miR-21調控PTEN/P13K/Akt增強順鉑對NSCLC細胞活性的抑制*

徐 飛,康 霞,宋慧琴,張海峰,李 麗,韋海濤△

(1.河南大學淮河醫院呼吸與危重癥醫學科,河南開封 475000;2.河南大學護理與健康學院,河南開封 475004;3.河南大學第一附屬醫院病理科,河南開封 475001;4.河南大學淮河醫院胸外科,河南開封 475000)

肺癌是世界上最常見的癌癥之一,也是癌癥相關死亡的主要原因[1],分為小細胞肺癌和非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)兩種類型,NSCLC約占所有肺癌患者的85%。對于早期NSCLC,主要的治療方法是手術;但對于一些局部晚期癌癥和轉移性疾病,主要治療方法是放化療聯合或姑息性化療。順鉑是一種有效的化療藥物且常用于多種癌癥的治療,但卻因細胞耐藥性而降低其療效[2]。在NSCLC的治療中,順鉑的耐藥已被證實[3]。長鏈非編碼RNA (long non-coding RNA,lncRNA)是一種蛋白質非編碼RNA[4]。近年來,在多種癌癥中發現了lncRNA的異常表達,且lncRNA在癌癥進展中的作用越來越受到人們的關注[5]。長基因間非蛋白編碼RNA 626 (LINC00626)是lncRNA家族的一員,被認為是一種新型的腫瘤抑制因子[6]。然而,LINC00626對 NSCLC細胞的順鉑的毒性影響尚不清楚。微RNA(microRNA,miRNA)也是一種非編碼RNA,是轉錄后的重要調控因子。miRNA在多種生物學進程中發揮著重要作用,miRNA的異常表達與包括癌癥在內的多種疾病有關[7],如NSCLC中miR-18a和miR-21的表達上調[8-9]。LncRNA可能與miRNA相互作用,并調控其靶點miRNA的表達[10]。本研究旨在分析LINC00626調節順鉑在NSCLC細胞毒性中的作用,探討LINC00626通過下調miR-18a和miR-21調控PTEN/PI3K/Akt通路,增強順鉑誘導NSCLC細胞活性的抑制作用,現報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

人正常支氣管上皮細胞系(16-HBE)和6種NSCLC細胞系(A549、HCC-857、H552、H520、H1975和GCT)購自中國科學院典型培養物保藏委員會細胞庫。耐順鉑A549細胞株(A549/CDDP)購自北京博奧森生物科技有限公司。10%胎牛血清購自美國Gibco公司。DMEM培養基、TRIZOL試劑、Lipofectamine2000試劑購自美國Invitrogen公司。Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit、SYBR Prime-Script miRNA RT-PCR Kit購自中國鄭州Takara公司。LINC00626過表達載體(pcDNA3.1-00626)、空載體(pcDNA3.1)、miR-18a 抑制劑、miR-21抑制劑、抑制劑對照、miR-18a模擬物、miR-21模擬物和模擬物對照由上海吉瑪制藥技術有限公司合成。pMIR-REPORT Luciferase載體質粒購自美國Ambion公司。雙熒光素酶報告測定系統,購自美國Promega公司。酶標儀、增強化學發光(enhanced chemiluminescence,ECL)試劑、蛋白分析試劑盒和Nitrocellulose膜購自美國Bio-Rad Laboratories公司。蛋白質提取試劑RIPA購自上海碧云天生物技術有限公司?？筆TEN、Akt、p-Akt(S473)、β-actin一抗和辣根過氧化物酶偶聯二抗購自美國Abcam公司。

1.2 方法

1.2.1細胞培養

將細胞放置在5% CO2、37 ℃的細胞培養箱中培養,培養基為含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素的DMEM培養基。

1.2.2實時熒光定量逆轉錄PCR

使用TRIZOL試劑從細胞中提取總RNA。用Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit進行逆轉錄。采用SYBR Prime-Script miRNA RT-PCR Kit,按照生產廠家說明書進行實時熒光定量逆轉錄PCR檢測。GAPDH作為mRNA(LINC00626)的標準化內參; U6作為miRNA(miR-18a和miR-21)的標準化內參。引物序列見表1。采用2-ΔΔCt法計算相對表達水平。

表1 相關基因的引物序列

1.2.3轉染

根據說明用Lipofectamine2000進行轉染。轉染細胞培養48 h后進行分析。

1.2.4四唑鹽(MTT)分析

用MTT法檢測細胞活性。將密度為5×103的A549、H1975和GCT細胞接種到96孔板中,與不同濃度順鉑(0、2.5、5.0、7.5、10.0、12.5 μmol/L)共孵育。A549/CDDP細胞與不同濃度的順鉑(0、2.0、4.0、8.0、16.0、32.0、64.0 μmol/L)孵育48 h。每孔加10 μL(5 mg/mL)MTT溶液孵育4 h。加入二甲基亞砜溶液溶解形成的10%甲醛溶液。用酶標儀測定490 nm處的吸光度。

1.2.5雙熒光素酶報告實驗

將LINC00626和PTEN的3′UTR片段擴增,分別克隆到pMIR-Report報告質粒中。通過兩步PCR方法獲取LINC00626或PTEN突變的3′UTR,并將其克隆到pMIR-Report中。為了分析LINC00626和miR-18a的相互作用,將野生型LINC00626(LINC00626-WT)或突變型LINC00626(LINC00626-MUT)的報告載體和miR-18a模擬物或模擬物對照共轉染到A549細胞中。為了分析LINC00626和miR-21的相互作用,將LINC00626-WT或LINC00626-MUT的報告載體和miR-21模擬物或模擬對照物共轉染到A549細胞中。為了分析PTEN是否為miR-18a的靶標,將野生型PTEN(PTEN-WT)或突變型PTEN(PTEN-MUT)的報告載體與miR-18a模擬物或模擬對照共轉染到A549細胞中。為了驗證PTEN是否為miR-21的靶點,將PTEN-WT或PTEN-MUT的報告載體與miR-21模擬物或模擬物對照共轉染到A549細胞中。48 h后使用雙熒光素酶報告測定系統,測定熒光素酶活性。海腎熒光素酶活性作為熒光素酶活性的標準化內參。

1.2.6蛋白質免疫印跡法

使用蛋白質提取試劑RIPA從細胞中提取總蛋白。用蛋白檢測試劑盒測定蛋白濃度。將蛋白裂解產物(50 μg)在12%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯凝膠電泳上分離,并在硝化纖維素膜上進行轉膜。用5%脫脂牛奶在Tris緩沖鹽水中室溫封閉2 h。隨后,將該膜與抗PTEN、Akt、p-Akt(S473)和β-actin一抗在4 ℃環境下孵育一夜。然后將膜與辣根過氧化物酶偶聯二抗,在室溫下孵育2 h。最后,根據制造商的說明書使用ECL試劑觀察免疫反應。

1.2.7裸鼠皮下荷瘤實驗

將濃度為5×106/200 μL順鉑+空載體和順鉑+LINC00626過表達載體的A549細胞分別接種到3～4周齡裸鼠皮下,每組各5只。待5～7 d肉眼可觀皮下明顯成瘤后,每3天測量1次瘤體體積,20 d后處死裸鼠,觀察成瘤情況,并記錄。

1.3 統計學處理

2 結 果

2.1 LINC00626、miR-18a和miR-21在NSCLC細胞中的表達水平

與16-HEB細胞比較,LINC00626在A549、HCC-857、H522、H520、H1975、GCT細胞中表達水平降低,miR-18a、miR-21在上述細胞中表達水平升高(P<0.05)。與A549細胞比較,A549/CDDP細胞的LINC00626表達水平降低,miR-18a、miR-21表達水平升高(P<0.05),見圖1。

A:LINC00626在NSCLC細胞中的表達水平;B:miR-18a在NSCLC細胞中的表達水平;C:miR-21在NSCLC細胞中的表達水平;D:LINC00626在A549和A549/CDDP細胞中的表達水平;E:miR-18a在A549和A549/CDDP細胞中的表達水平;F:miR-21在A549和A549/CDDP細胞中的表達水平;a:P<0.05,與16-HBE細胞比較;b:P<0.05,與A549細胞比較。圖1 NSCLC細胞中LINC00626、miR-18a和miR-21的表達水平

2.2 順鉑對NSCLC細胞毒性的影響

順鉑濃度為5.0、7.5、10.0、12.5 μmol/L時,可以明顯抑制A549、H1975細胞的活力(P<0.05)。順鉑濃度為2.5、5.0、7.5、10.0、12.5 μmol/L時,可以明顯抑制GCT細胞的活力(P<0.05)。順鉑濃度為16.0、32.0和64.0 μmol/L時,可明顯抑制A549/CDDP細胞的活力(P<0.05),見圖2。

A:順鉑對A549細胞的毒性;B:順鉑對H1975細胞的毒性;C:順鉑對GCT細胞的毒性;D:順鉑對A549/CDDP細胞的毒性;a:P<0.05,與0 μmol/L順鉑比較。圖2 順鉑對NSCLC細胞毒性的影響

2.3 LINC00626、miR-18a和miR-21對順鉑誘導NSCLC細胞活力抑制的影響

LINC00626過表達抑制了A549、H1975、GCT和A549/CDDP細胞的活力,LINC00626過表達增強了順鉑的抑制作用(P<0.05)。miR-18a和miR-21抑制劑對A549、H1975、GCT和A549/CDDP細胞的活力有抑制作用(P<0.05)。此外,miR-18a和miR-21抑制劑可增強順鉑的抑制作用(P<0.05),見圖3。

A:LINC00626對順鉑誘導NSCLC細胞活性抑制的影響;B:miR-18a對順鉑誘導NSCLC細胞活性抑制的影響;C:miR-21對順鉑誘導NSCLC細胞活性抑制的影響;a:P<0.05。圖3 LINC00626、miR-18a和miR-21對順鉑誘導NSCLC細胞活力抑制的影響

2.4 miR-18a和miR-21是NSCLC細胞中LINC00626的直接靶點

與LINC00626-WT+模擬物對照的細胞比較,LINC00626-WT+miR-18a模擬物、LINC00626-WT+miR-21的A549細胞熒光素酶活性降低(P<0.05)。過表達LINC00626抑制了miR-18a和miR-21的表達水平,見圖4。

A: LINC00626的結合位點預測;B:miR-18a/miR-21的結合位點預測;C:miR-18a雙熒光素酶報告實驗;D:miR-21雙熒光素酶報告實驗;E:miR-18a的表達水平;F:miR-21的表達水平;1:LINC00626-WT+模擬物對照;2:LINC00626-WT+miR-18a模擬物;3:LINC00626-WT+miR-21模擬物;4:LINC00626-MUT+模擬物對照;5:LINC00626-MUT+miR-18a模擬物;6:LINC00626-MUT+miR-21模擬物;a:P<0.05。圖4 miR-18a和miR-21是LINC00626的直接靶點

2.5 miR-18a和miR-21抑制了LINC00626對NSCLC細胞活力的影響

LINC00626過表達增強了順鉑對細胞活力的抑制作用,而miR-18a或miR-21 上調可以減弱這一抑制作用,見圖5。

A:miR-18a對A549細胞活性的影響;B:miR-18a對H1975細胞活性的影響;C:miR-21對A549細胞活性的影響;D:miR-21對H1975細胞活性的影響;1:空載體;2:順鉑+空載體;3:順鉑+LINC00626過表達載體;4:順鉑+LINC00626過表達載體+模擬物對照;5:順鉑+LINC00626過表達載體+miR-18a模擬物;6:順鉑+LINC00626過表達載體+miR-21模擬物;a:P<0.05。圖5 miR-18a和miR-21可以抵抗LINC00626對NSCLC細胞活力的影響

2.6 PTEN是miR-18a和miR-21的直接靶點

與PTEN-WT+模擬物對照組比較,PTEN-WT+miR-18a模擬物、PTEN-WT+miR-21模擬物的A549細胞熒光素酶活性降低(P<0.05)。miR-18a、miR-21上調后,PTEN表達水平降低(P<0.05);而miR-18a、miR-21下調后,PTEN表達增加(P<0.05),見圖6。

A:PTEN和miR-18a之間的結合位點;B:PTEN和miR-21之間的結合位點;C:miR-18a雙熒光素酶報告實驗;D:miR-21雙熒光素酶報告實驗;E:miR-18a蛋白免疫印跡法;F:miR-21蛋白免疫印跡法;1:PTEN-WT+模擬物對照;2:PTEN-WT+miR-18a模擬物;3:PTEN-WT+miR-21模擬物;4:PTEN-MUT+模擬物對照;5:PTEN-MUT+miR-18a模擬物;6:PTEN-MUT+miR-21模擬物;a:P<0.05。圖6 PTEN是miR-18a和miR-21的靶點

2.7 LINC00626通過下調miR-18a和miR-21調控PTEN/PI3K/Akt通路

LINC00626過表達增加了PTEN的表達水平,降低了p-Akt/Akt的比值(P<0.05)。miR-18a模擬物、miR-21模擬物減弱了LINC00626過表達對PTEN表達和p-Akt/Akt比值的影響(P<0.05)。miR-18a抑制劑、miR-21抑制劑逆轉了LINC00626過表達對PTEN表達和p-Akt/Akt比值的影響(P<0.05),見圖7。

A:蛋白免疫印跡法;B:PTEN灰度分析;C、D:p-Akt/Akt灰度分析;1:空載體;2:LINC00626過表達載體;3:LINC00626過表達載體+模擬物對照;4;LINC00626過表達載體+miR-18a模擬物;5:LINC00626過表達載體+miR-21模擬物;6:LINC00626過表達載體+抑制劑對照;7:LINC00626過表達載體+miR-18a抑制劑;8:LINC00626過表達載體+miR-21抑制劑。圖7 LINC00626通過下調miR-18a和miR-21來調控PTEN/PI3K/Akt通路

2.8 LINC00626促進裸鼠體內順鉑抑制細胞活力作用

與順鉑+空載體比較,順鉑+LINC00626過表達載體荷瘤小鼠瘤體體積小、質量減少,差異有統計學意義(P<0.05),見圖8。

A:荷瘤小鼠及瘤體;B:瘤體體積;C:瘤體質量;a:P<0.05。圖8 LINC00626在裸鼠體內增強順鉑抑制NSCLC活性

3 討 論

lncRNA代表了一大類功能性RNA分子,在人類癌癥發生、發展過程中起著重要作用[11]。lncRNA可以作為基因調節劑,影響多種癌癥的生物過程[12-14]。LINC00626是一種腫瘤抑制因子[15]。本研究發現與16-HBE細胞比較,LINC00626在NSCLC細胞系中低表達。miR-21是一種致癌基因,已被發現在包括NSCLC的癌癥中上調[16]。據報道,高血漿miR-18a與不良預后相關,表明miR-18a可能會在NSCLC患者中作為一種新的和有發展前景的預后生物標志物[9,17-18]。

既往研究表明,直腸癌組織中LINC00626表達下調,且LINC00626低表達與生存時間短、臨床病理特征差有關,過表達LINC00626抑制直腸癌細胞增殖[15]。本研究發現低濃度順鉑(2.5 μmol/L)對A549和H1975細胞無毒性。LINC00626過表達使A549和H1975細胞對順鉑(2.5 μmol/L)敏感性增強。LINC00626過表達增強順鉑(2.5 μmol/L)對GCT細胞的抑制作用。過表達LINC00626也使A549/CDDP細胞對順鉑(8.0 μmol/L)敏感。TANG等[19]研究表明,miR-21可能通過干擾肺癌細胞中SMAD7的表達來促進細胞增殖、遷移和侵襲。另一項研究結果顯示,miR-21的明顯增加可能反映了局部炎癥對全身反應的影響[20]。TSE等[21]研究表明,miR-21與胃癌進展有關,并將miR-21確立為胃癌的穩健治療靶點。此外,miR-18a與鼻咽癌化療敏感性有關[22]。本研究發現下調miR-18a和miR-21可增強順鉑對A549、H1975和GCT細胞活性的抑制作用。miR-18a和miR-21下調也可使A549/CDDP細胞對順鉑(8.0 μmol/L)敏感性增強。

miR-21抑制劑可以有效緩解結腸炎癥狀、抑制結腸血管生成,調控PTEN、PI3K和p-Akt的表達,提示miR-21抑制劑通過PTEN/PI3K/Akt通路抑制結腸炎小鼠結腸炎和血管生成[23]。miR-21通過PTEN/PI3K/Akt通路促進克羅恩患者臍靜脈內皮細胞增殖和遷移[24]。miR-21也可以通過PTEN/PI3K/Akt調節卵巢癌細胞的增殖和凋亡[25]。此外,miR-18a通過調節PTEN/PI3K/Akt/mTOR信號軸上調Cyclin D1,促進食管鱗狀細胞癌細胞的增殖[26]。本研究發現,在NSCLC中PTEN是miR-18a和miR-21的直接靶點,LINC00626通過下調miR-18a和miR-21調控PTEN/PI3K/Akt通路。

綜上所述,LINC00626在NSCLC細胞系中低表達,且增強了順鉑對細胞活性的抑制作用。miR-18a和miR-21是NSCLC中LINC00626的靶點。在NSCLC中,PTEN被發現是miR-18a和miR-21的直接靶點,PTEN/PI3K/Akt通路參與了LINC00626的調節。因此,LINC00626通過抑制miR-18a和miR-21調控PTEN/PI3K/Akt通路,增強順鉑誘導的NSCLC細胞活力抑制作用。