山西中藥大棗的嫩葉總DNA 提取方法的研究

張 琰，宋金玉

（山西藥科職業學院，山西太原 030031）

我國棗樹種質資源極為豐富，《中國果樹志棗卷》中記載的棗樹品種就有700 多個。之前我國學者在棗樹栽培、良種選育、快速繁殖方面研究較多，但是如何將繁多的品種進行鑒別分類以便種質更好的保存是當前棗樹種質資源研究的重點。近十幾年來國內外迅速發展起來的分子標記技術如AFLP 技術（擴增片段長度多態性）是棗樹品種鑒定的有效方法，既具有PCR 的高效性、安全型和方便性的特點，又具有RFLP 可靠性好，重復性高的優點，被廣泛用于植物科學研究的各個方面[1］。不同的DNA 提取技術對AFLP 的試驗影響非常大，本文對棗樹葉片DNA 的提取進行了試驗研究，旨在為后續棗樹葉片AFLP 體系的建立做好準備，同時也為棗樹資源品種分類、鑒別奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

植物：試驗所用材料為交城駿棗幼嫩葉片、太谷壺瓶棗幼嫩葉片、運城梨棗幼嫩葉片，均采自于山西臨猗棗樹研究所。葉片采集后立即放置于密封袋中，用冰盒帶回實驗室。然后置于冰箱冷凍室-80℃保存。

主要儀器：臺式高速離心機：TGL-16G 型（上海醫用分析儀器廠）；電泳儀：HV-3000 型高壓穩壓電泳儀（北京東方儀器廠）；干燥箱：熊貓牌DGF20 型電熱鼓風干燥箱（南京實驗儀器廠）；凝膠成像系統：TMW-20 Transilluminator（美國，DELL）；DNA 混合儀（寧波新芝科器研究所）；TU-1810 紫外可見分光光度計；移液槍、恒溫水浴鍋等。

試劑：昆明晨致遠綠有限公司生產的快捷型植物基因組DNA 提取系統試劑盒、氯仿溶液、異戊醇溶液、異丙醇、RNase、CTAB 緩沖液、3.5mol/L 的NaAc 溶液、70%乙醇、無水乙醇等。

1.2 方法

常規CTAB 法 取1g 棗幼嫩葉片，于液氮中研成粉。將棗葉凍粉轉入到預冷離心管中，立即加入等體積 (w/v)2×CTAB 提取緩沖液，65℃保溫10～20min，其間不時搖晃。加入等體積的氯仿—異戊醇，輕緩顛倒離心管進行混勻，室溫下，12 000r/min 離心10～20min。將上清液轉入另一離心管中，加入等體積的氯仿- 異戊醇，顛倒離心管混勻，于室溫在12 000r/min 離心10min。將上層水相轉入新的經硅烷化處理的離心管中，加入0.6 倍-1 倍體積的異丙醇，混勻，室溫下放置約30min。3 500～4 000r/min 離心5～10min，去上清液，70%乙醇漂洗，沉淀吹干。風干后加入適量蒸餾水溶解DNA。待DNA 完全溶解后，加入1～2μLRNase（10mg/mL），于37℃保溫1h 以去除DNA 中的RNA。4℃保存備用。取2μLDNA 溶液電泳檢測。

改良CTAB 法：在參考陳娟等改良CTAB 法的基礎上稍作改進以適合紅棗葉片DNA 提取的要求，即是在2%CTAB提取液中加入2%抗氧劑β- 巰基乙醇和2%螯合劑PVP40，排除酚類物質和色素的干擾[2］。在用酚-氯仿抽提DNA 時在去除RNA 的時候加入1/10 體積的3.5mol/L 的NaAc，再加入無水乙醇沉淀DNA 去除多糖。

試劑盒法：稱取100mg 棗葉片干材料，加入少量石英砂研磨成細粉末狀，將棗葉片粉末裝到2.0mL 的離心管中。采用快捷型植物基因組DNA 提取系統試劑盒，再嚴格按照試劑盒的操作說明進行DNA 的提取。

1.3 DNA 檢測方法

紫外分光光度計檢測：取出2μL DNA 溶液，用紫外可見分光光度計分別測定OD260/OD280、OD260/OD230、DNA 濃度，重復3 次，取平均值。

瓊脂糖凝膠電泳檢測：取1μL DNA 提取樣品和2μL 上樣緩沖液（0.25%溴酚藍+40%蔗糖），混勻后點入膠孔，標準分子量為稀釋的200ngDNAladder。輸出電壓90V，恒壓電泳20～30min。電泳完畢后，將凝膠從電泳槽中取出，凝膠成像系統觀察拍照。

2 結果

2.1 紫外分光光度計DNA 檢測

通過常規CTAB 法、改良CTAB 法、試劑盒法抽提棗嫩葉總DNA，試驗結果表明，3 種方法均能有效抽提棗葉片總DNA，但在DNA 的提取濃度和純度上有所差異。高純度DNA 的OD260/OD280 值應在1.8～2.0 之間。當OD260/OD280 小于1.8時，DNA 樣品中可能存在蛋白質污染；當OD260/OD280 大于2.0 時，DNA 樣品中RNA 含量較高[3］。當OD260/OD230 的數值大于2.0 且小于2.4，表明小分子鹽離子、色素、多糖或醇等雜質含量較少，在此范圍之外說明有污染，一般小于2.0 說明有胍基或巰基乙醇殘留[4］。本試驗采用常規CTAB 法、改良CTAB 法、試劑盒法抽提DNA 的OD260/OD280 值分別在1.60～1.90、1.83～1.95、1.86～1.98 之間，表明改良CTAB 法和試劑盒法均能較好地去除蛋白質、RNA、多糖等大分子物質，獲得純度較高的DNA，而常規CTAB 法由于OD260/OD280 有時小于1.8，說明DNA 樣品中可能存在蛋白質污染，純度不夠高。常規CTAB法、改良CTAB 法、試劑盒法抽提DNA 的濃度分別在258.8～421.2、285.2～458.6、410.5～486.1 之間，表明這三種方法均能獲得較高的DNA 濃度。但是試劑盒法抽提的DNA 濃度是最高的。常規CTAB 法、改良CTAB 法、試劑盒法抽提DNA 的OD260/OD230 值均在2.0～2.4 之間，表明這3 種方法均能有效去除小分子鹽類等物質。見表1。

表1 三種方法抽提棗葉片總DNA 結果比較ng/μL

2.2 瓊脂糖凝膠電泳DNA 檢測（0.8%瓊脂糖凝膠電泳）

將常規CTAB 法、改良CTAB 法、試劑盒法抽提的DNA 在0.8%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。其電泳圖譜見圖1、2、3。瓊脂糖凝膠電泳結果顯示：常規CTAB 法抽提的DNA 電泳條帶有拖尾或彌散現象且條帶不太亮，說明個別點樣孔內有蛋白質、多糖或酚類等大分子物質干擾，而且抽提的DNA 濃度低。改良CTAB 法抽提的DNA 電泳條帶稍有拖尾或彌散現象，但是條帶亮度尚可，說明DNA 比較純凈，蛋白質等大分子物質干擾較少，抽提的DNA 濃度較好。試劑盒法抽提的DNA 電泳譜帶整齊清楚無任何拖尾或彌散現象，亮度很好，說明試劑盒法抽提的DNA 濃度高純度好，DNA 完整，點樣孔內均很干凈，說明蛋白質、多糖、酚類等雜質去除的比較徹底。相比較其他兩種方法更適合于棗嫩葉片DNA 的提取。在用紫外分光光度計進行DNA 檢測時，其結果也同樣顯示試劑盒法提取的DNA 濃度最高，與瓊脂糖凝膠電泳結果保持相一致。

圖1 常規CTAB 法抽提的DNA 瓊脂糖凝膠電泳圖譜

圖2 改良CTAB 法抽提的DNA 瓊脂糖凝膠電泳圖譜

圖3 試劑盒法抽提的DNA瓊脂糖凝膠電泳圖譜

3 討論

經過3 種方法抽提DNA 的結果比對，可以看出紫外分光光度計DNA 檢測和瓊脂糖凝膠電泳DNA 檢測結果基本具有一致性。常規CTAB 法抽提的DNA 有蛋白質、多糖、酚類等大分子物質的雜質干擾，改良CTAB 法抽提的DNA 雜質干擾較少，濃度較好。而試劑盒法抽提的DNA 是最好的，濃度高純度好，蛋白質、多糖、酚類等大分子物質的雜質去除徹底，用此種方法提取的DNA 可用于后續的試驗研究分析。

植物DNA 的提取方法比較多，而且也是比較成熟的，但由于不同植物它們各自的結構不同，生物化學成分也不同，其具體的操作方法也稍有些不同。常規CTAB 法抽提的DNA 濃度和純度均較低，可能是因為氯仿抽提次數過多導致濃度較低，而水浴時間過長導致了純度較低。常規CTAB 法將多糖、酚類等這些雜質去除不夠完全徹底，而酚類等物質會使基因組DNA 雙鏈氧化，破壞植物基因組的完整性，降低序列長度，造成DNA 片段化，嚴重干擾了DNA 的提取；多糖類物質與DNA 的理化性質較為相近，造成多糖與核酸的共同沉淀而使DNA 的濃度降低。植物葉片越為成熟，含有的多糖、酚類物質就越多，所以應盡可能采集幼嫩植物葉片作為DNA 的提取材料。使用氯仿抽提次數過多會造成DNA 損失即DNA 濃度降低，所以只需要采用兩次氯仿進行抽提[5］。因此，在進行棗葉片DNA 提取時盡量選擇幼嫩的葉片進行提取，在常規CTAB法基礎上進行合理改良得到適合棗葉片DNA 提取的方法。當然也可以選擇使用合適的試劑盒進行DNA 有效方便的提取。本試驗研究發現山西棗葉片DNA 的提取用試劑盒提取效果最好，濃度、純度都比較滿意，可以為后續山西棗葉片AFLP的研究奠定良好的基礎。