液相色譜質譜法同時檢測動物源性食品中多種獸藥殘留的方法建立及優化

◎ 關松梅，楊吉祥，柴瓏瓏，王 品

（青島元信檢測技術有限公司，山東 青島 266000）

我國經濟發展呈現出穩步向前推進的態勢，在此背景下，我國畜牧行業發展迅速，人們對畜牧產品的需求也在不斷提升[1]。在畜牧養殖過程中，獸藥的合理應用對保障動物源性食品安全具有重要作用。在畜牧養殖過程中，獸藥使用不合理的現象層出不窮，獸藥的濫用易使畜牧產品遭受嚴重污染，藥物經代謝進入動物源性食品中，之后可通過食物鏈在人體蓄積，不僅能使人體產生抗藥性、引起過敏反應、影響腸道內菌群，還能導致中毒等不良反應。使用獸藥不合理、濫用獸藥等問題嚴重威脅畜禽產品食用者的生命健康[2-6]。因此，動物源性食品中的獸藥殘留引起了廣泛關注。

隨著經濟的發展，人們對食品安全性的要求越來越高。動物源性食品是人們餐桌上的必需品，檢測獸藥殘留是保障動物源性食品安全的必要手段。目前，我國在畜牧養殖方面有近百種獸藥在投入使用，使用較多的獸藥有四環素類[7-8]、β-受體激動劑類[9]、磺胺類[10-12]、喹諾酮類、硝基咪唑類和氯霉素類等，主要使用液相色譜串聯質譜法檢測[13-15]。這些獸藥殘留大部分都有相應的國家標準檢測方法，但每個標準大都只檢測其中的一類或者一類中的幾種獸藥殘留。這無疑大大增加了檢測工作的難度，因此建立及優化能同時檢測多種獸藥殘留的方法將會極大提升日常檢測工作的質量和效率，對降低人力、物力及時間成本大有益處。

選取豬肉、雞肉、雞蛋、牛肉、蝦、淡水魚和海水魚等7 種基質，通過多獸藥殘留凈化柱凈化提取，經過高效液相色譜質譜儀檢測，可實現多種獸藥殘留同時提取、同時上機檢測，可彌補常規檢測費時費力的缺點，具備高效、快速、準確等特點，可用于快速篩查高風險樣品，為我國動物源性食品安全提供保障。

1 材料與方法

1.1 儀器與設備

6470B-1290 型高效液相色譜- 質譜聯用儀，美國安捷倫公司產品；電子天平，卓精公司產品；CPA225D 型分析天平，sartorius 公司產品；FM-40 低速離心機，蜀科儀器公司產品；多管渦旋混合振蕩器，MIULAB 公司產品；KQ-500DB 型數控超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司。

1.2 材料與試劑

甲醇：色譜純，默克公司產品；乙腈：色譜純，莫克公司產品；甲酸：色譜純，科密歐試劑公司產品；水：娃哈哈純凈水。

標準品：磺胺類和喹諾酮類混合標準品，北京壇墨公司產品，純度為95%；β 受體激動劑混合標準品，北京壇墨公司產品，純度為97%；四環素類混合標準品，北京壇墨公司產品，純度為95%；氯霉素類緩和標準品，北京壇墨公司產品，純度為97%；硝基咪唑類標準品、沙丁胺醇-D3、萊克多巴胺-D6、克倫特羅-D9、氯霉素-D5 均購于北京壇墨公司或北京曼哈格公司，純度均大于95%。

1.3 試驗條件

1.3.1 液相條件

色譜柱：ZORBAX Eclipse C18柱（2.1 mm 50 mm，1.8 μm）；流速：0.300 mL·min-1；進樣量：2.0 μL；柱溫：30 ℃。流動相：0.1%甲酸水（A）和乙腈（B），梯度洗脫程序見表1。

表1 梯度洗脫程序表

1.3.2 質譜條件

離子模式（ESI+、ESI-）；多反應監測模式；氣流速：3 mL·min-1；離子源溫度：300 ℃；霧化氣、鞘氣為普通氮氣，碰撞氣為高純氮氣，使用前調節各氣體流量使質譜靈敏度達到檢測要求。定性、定量離子及對應的碎裂電壓和碰撞能量優化到最佳參數。質譜參數見表2。

1.4 試驗方法

1.4.1 樣品的前處理

準確稱取豬肉、雞肉、雞蛋、海水魚、海水蝦、淡水魚和牛肉5.0 g（精確至0.01 g）于50 mL 具塞離心管中，加入同位素內標和84%乙腈水溶液6.00 mL（含2%甲酸），渦旋10 min，超聲提取30 min，以轉速4 000 r·min-1離心5min，上清液全部過多獸殘凈化柱，渦旋10 min，4 000r·min-1離心5 min，取上清液過0.22 μm 濾膜，供高效液相色譜質譜儀測定。

1.4.2 標準曲線的配制

將磺胺類和喹諾酮類混合標準品、四環素類混合標準品分別配制成1 000 ng·mL-1；β 受體激動劑混合標準品、氯霉素標準品、硝基咪唑類標準品、沙丁胺醇-D3、萊克多巴胺-D6、克倫特羅-D9、氯霉素-D5均配制成100 ng·mL-1。將豬肉、雞肉、牛肉、雞蛋、蝦、淡水魚和海水魚等基質經上述前處理過程提取后，配制成基質混合標曲，其中磺胺類、喹諾酮類、四環素類配制成5 ng·mL-1、10 ng·mL-1、50 ng·mL-1、100 ng·mL-1、200 ng·mL-1，β受體激動劑類、氯霉素類、硝基咪唑類配制成0.5 ng·mL-1、1.0 ng·mL-1、2.0 ng·mL-1、5.0 ng·mL-1和10.0 ng·mL-1，內標加入10 μL，現配現用。

2 結果與分析

2.1 樣品提取試劑的選擇

提取試劑對多種獸藥殘留的回收率、目標峰出現時間以及峰形都有重要影響。日常檢測獸藥殘留的數據顯示，常用的提取試劑為甲醇或乙腈，經查閱文獻了解到甲醇會提取過多的脂肪，降低大多數獸藥殘留的回收率，而乙腈溶解性好、滲透強，能夠沉淀蛋白并且不會提取過多脂肪，乙腈作為提取試劑的加標回收率較高[16]。但是蛋白質在有機溶劑中會凝結成團，在提取試劑中加入適量的純水，可減少乙腈比例以及減慢均質成團現象。多數待測物中含有堿性基團，甲酸為其提供酸性環境，與堿性基團形成有機鹽，可進一步提高回收率[17-18]。因此選擇70%、84%、90%乙腈水進行提取，結果顯示84%乙腈水回收率最高。選擇84%乙腈水含0.2%甲酸、1%甲酸、2%甲酸，結果顯示84%乙腈水溶液（含2%甲酸）整體回收率在60%～120%。

2.2 凈化柱

不同基質的多獸藥殘留檢測多采用固相萃取柱，但該凈化操作較為復雜，且時間較長，本方法采用一種新的多獸藥殘留凈化柱，簡單方便易操作。將不同基質的樣品用84%乙腈水（含2%甲酸）提取過濾后直接用高效液相色譜質譜儀檢測和用84%乙腈水（含2%甲酸）提取過濾后過多獸藥殘留凈化柱再用高效液相色譜質譜儀檢測的結果進行比對，發現不經過凈化柱的雞蛋中的氯霉素基本無回收，牛肉中β 受體激動劑類基本無回收，經過凈化柱凈化后，所有基質的整體回收率均在60%～120%。凈化柱可去掉大部分雜質，改善目標峰的峰形，提高回收率。

2.3 基質效應

采用LC-MS/MS 分析樣品，基質效應對定量結果的準確性有著極大的影響。基質效應是指在樣品測定過程中，基質存在導致目標物響應產生變化的現象[19]。為檢測基質效應的影響，分別采用空白基質曲線及相應含量溶劑曲線，在相同的儀器條件下，比較空白基質曲線和溶劑曲線目標化合物的離子強度進而評價基質效應[19]。結果顯示，所有基質中除了環丙沙星、恩諾沙星、磺胺甲惡唑和磺胺甲基咪定為基質增強外，其余均為基質抑制，所以該方法采用基質標曲和內標定量的方法來對抗基質效應。氯霉素、克倫特羅、沙丁胺醇、萊克多巴胺添加內標，所有化合物均采用基質標曲進行定量，可有效降低基質效應的影響。

2.4 檢出限、定量限及準確度的測定

在空白豬肉、雞肉、牛肉、蝦、淡水魚、雞蛋和海水魚中分別做標準中定量限的1 倍、2 倍、10 倍加標，每個水平做6 個平行樣品，按照上述前處理方法和液相質譜條件進行提取凈化和上機檢測，結果表明各化合物的定量限均符合國家標準規定，加標回收率均在70%～120%，相對偏差RSD 均小于10%，證明本方法的準確性良好。檢出限、定量限見表3。

表3 檢出限、定量限表

3 結論

建立了高效液相色譜質譜同時檢測35 種獸藥殘留的方法，該方法較現在發布實施的國家標準具有更簡單、高效的特點，能夠實現同時檢測多種獸藥殘留，可縮短檢測周期，可用于食品檢測領域的快速篩查，為食品安全保駕護航。