蠟樣芽胞桿菌根狀生長實驗方法探討

◎ 廖麗輝，侯艷飛，秦 捷，向忠平

（湖南省懷化市疾病預防控制中心，湖南 懷化 418000）

蠟樣芽胞桿菌在自然界中廣泛存在，很容易引起食物污染，食物受該菌產毒菌株污染后，從外觀、氣味上無顯著變化，食入后會引起食物中毒[1]。中毒后，還可引起敗血癥、心內膜炎、創傷和肺部感染等疾病[2]。蠟樣芽胞桿菌與蕈狀芽胞桿菌在實驗室檢測中生化實驗很相近，難以區分，而根狀生長是區分二者的重要實驗，而國標中的“山谷狀生長”和“根狀生長”受很多因素影響，易導致主觀誤判，造成假陽性。因此，精準快速的檢測出蠟樣芽胞桿菌尤為重要。為了解不同條件下蠟樣芽胞桿菌和蕈狀芽胞桿菌根狀生長檢測效果，本文選擇蠟樣芽胞桿菌標準菌株、蕈狀芽胞桿菌標準菌株、實驗室分離株，用普通營養瓊脂培養基（Nutrient Agar，NA）、平板計數瓊脂培養基（Plate Count Agar，PCA）、胰酪大豆胨瓊脂培養基（Tryptose Soya Agar，TSA）、含0.6%酵母膏的胰酪胨大豆瓊脂培養基（Trypticase Soy-Yeast Extract Agar，TSA-YE），在單因素變量情況下，篩選根狀生長實驗最佳條件。

1 材料與方法

1.1 材料與設備

NA 培養基、PCA 培養基、TSA 培養基、TSA-YE培養基、腦心浸出液肉湯、血瓊脂平板均由青島海博技術有限公司生產；蠟樣芽胞桿菌標準菌株（CMCC 63306）、蕈狀芽胞桿菌標準菌株（ATCC 10206）、實驗室檢出的蠟樣芽胞桿菌30株，蕈狀芽孢桿菌20株。

NU-425-400 生物安全柜（Nuaire 公司）、GHP-9160 隔水式恒溫培養箱（上海一恒）、TP-3000E 電子天平（湘儀天平）、SQ510C 高壓滅菌器（雅馬拓科學）、HRCJ-2D 超凈工作臺（青島海爾）。

1.2 實驗前準備

將蠟樣芽胞桿菌標準儲備菌株（簡稱LY 標株）、蕈狀芽胞桿菌標準儲備菌株（簡稱XZ 標株）、實驗室蠟樣芽胞桿菌（簡稱LY）、實驗室蕈狀芽胞桿菌（簡稱XZ）用腦心浸出液肉湯復蘇，37 ℃培養過夜，后轉至血平板上，待培養過夜后做根狀生長實驗。

1.3 實驗方法

將經過高壓滅菌的NA、PCA、TSA、TSA-YE培養基用移液管分別吸取9 mL、12 mL、15 mL、18 mL、20 mL 加入無菌平板中，打開蓋子讓其自然凝固，以減少瓊脂表面的水分。不同的量體現平板培養基的厚度有所不同。將所有平板置于37 ℃溫箱烘干5 h 后，使其在室溫條件下過夜干燥。本次實驗中蕈狀標株（XZ 標株）為陽性對照株，分別用一次性無菌接種針將復蘇好的菌株在上述不同量不同種類的培養基上做根狀生長實驗，然后分別放置在30 ℃和37 ℃恒溫隔水式培養箱中培養，分別在24 h、48 h、72 h 時觀察培養狀態。

1.4 判斷標準

依據《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 蠟樣芽胞桿菌檢驗》（GB 4789.14 2014）[3]對根狀生長實驗進行判別：山谷狀生長判為陰性，根狀生長判為陽性。

2 結果與分析

2.1 血平板培養結果

蠟樣芽胞標準菌株在血平板上出現較寬的溶血環，表現為完全透明的β 溶血現象，蕈狀芽胞桿菌標準菌株在血平板上溶血現象較蠟樣標準菌株略弱，而實驗室蠟樣芽胞桿菌和蕈狀芽胞桿菌大部分出現完全透明溶血環，僅個別菌株表現為草綠色溶血現象。

2.2 20 h、24 h 觀察結果

經20 h 觀察，僅37 ℃和30 ℃PCA 上的XZ 標株與其中的3 株XZ 劃線邊緣略有毛刺，表現有輕微根狀現象，但其他平板上菌株劃線邊緣未見毛刺，僅沿接種線生長，結果無法判別。經24 h 觀察所有平板，30 ℃培養條件下，9 mL 的NA 和TSA 瓊脂平板上小部分XZ 劃線邊緣有微細且短的毛刺生長，但不足以判別陰陽性。而9 mL 和12 mL PCA 瓊脂平板上，經24 h 培養的XZ 標株可見微小毛刺，其他XZ 不夠明顯，LY 標株基本上沿劃線生長，未表現山谷狀生長，9 mL PCA上30℃ 培養24 h的菌株生長形態如圖1所示。

圖1 30 ℃ 24 h 9 mLPCA 上菌落生長形態圖

2.3 48 h 觀察結果

經48 h 觀察，30 ℃培養條件下，9 mL 的PCA、NA、TSA、TSA-YE 上大部分蕈狀可見粗短不整齊的邊緣，大部分蠟樣在上述平板上沿接種線生長，邊緣有類似不規整的波浪狀，擴張于接種線外，故此時判定根狀生長陰陽性結果不夠準確，但不同種類平板中，PCA 和NA 效果更佳。37 ℃培養條件下，因菌落生長快，整體偏大，導致蕈狀毛刺不明顯，且蠟樣芽胞桿菌山谷狀的形態不能顯現出來，容易誤判。30 ℃ PCA和NA 平板上的生長特征如圖2 所示。

圖2 30 ℃ 48 h 9 mL PCA 和NA 上菌落生長形態圖

2.4 72 h 觀察結果

經72 h 觀察，30 ℃條件下9 mL 的PCA、NA、TSA、TSA-YE均可判定根狀生長陰陽性結果：LY及LY標株呈山谷狀生長，結果判陰性，XZ 和XZ 標株呈根狀生長，結果判陽性。選取LY 標株、XZ 標株及其中一株食品LY 株，生長狀態見圖3、圖4、圖5、圖6。因其他平板均帶XZ 標株、LY 標株做對照，故不一一呈現。

圖3 30 ℃ 72 h PCA 上菌落生長形態圖

圖4 30 ℃ 72 h NA 上菌落生長形態圖

圖5 30 ℃ 72 h TSA-YE 上菌落生長形態圖

圖6 30 ℃ 72 h TSA 上菌落生長形態圖

經觀察，瓊脂厚度越薄，同一種培養基根狀生長實驗越容易區分。9 mL 和12 mL 的4 種不同種類的平板結果表明，在PCA 平板、NA 平板、TSA 平板上30 株LY 均可明顯看到菌苔沿接種線擴張生長，且呈波浪紋，無細小毛刺，即呈現明顯山谷狀生長現象，結果為陰性，20 株XZ 均可見豐富的毛須，且較LY的波浪狀更細更密集，樹根樣擴展開，呈現根狀生長，結果為陽性，生長現象見圖3、圖4、圖5（右上角平板）。同時，LY標株和XZ標株均可判定結果。而TSA-YE上，30 株LY 均呈現山谷狀生長，18 株XZ 判為根狀生長，還有2 株XZ 根狀現象無法判別。

當瓊脂量在15 mL 時，PCA 瓊脂上29 株LY 和18 株XZ 仍可判斷結果，NA 瓊脂上28 株LY 和19 株XZ 可判斷結果，TSA 瓊脂上27 株LY 和14 株XZ 可判斷結果，TSA-YE 瓊脂上24 株LY 和5 株蕈狀可判斷結果。

當瓊脂量在18 mL 和20 mL 時，所有平板上菌苔均沿線擴大，整體較粗，易影響結果判斷，PCA 瓊脂上15 株LY 和6 株XZ 結果比較明顯，NA 瓊脂上13 株LY 和5 株XZ 結果也可判別。在TSA 和TSA-YE上，18 mL 雖較20 mL 菌苔窄，但總體偏粗，均出現大鋸齒狀，導致XZ 和LY 邊緣生長特征均不明顯，無法判別。

37 ℃培養條件下，菌株在劃線上因生長過快而較粗大，會影響結果判斷，整體看來，LY 結果受影響較少，故不容易出現假陰性，但XZ 結果受瓊脂厚度影響較大，易造成假陽性結果，且瓊脂量越多，即厚度越厚，假陽性率越高。從不同種類的瓊脂來看，PCA效果最佳。

3 結論與討論

蠟樣芽胞桿菌的繁殖體較為耐熱，加熱100 ℃20 min 可以被殺死，它產生的芽孢可在環境中長期存在并大量繁殖[4]，引起的中毒事件屢見不鮮，準確快速地區分蠟樣和蕈狀的實驗工作極其重要，從上述實驗結果可發現，根狀生長實驗可以受培養基種類、培養基厚度、培養溫度、培養時間等因素影響，尤其對于從事蠟樣芽胞桿菌檢測的新人員來說有一定難度，實驗結果受主觀影響，容易將蕈狀判為蠟樣，從而直接影響腸毒素等后續檢測工作，導致結果出錯。尤其在由蠟樣引起的食物中毒發生時，快速提高檢測能力，準確查出致病因子是重中之重。受多因素影響，實際工作中蕈狀和蠟樣在MYP 平板上形態很相近，不具有典型菌落形態，且因蠟樣的動力實驗有些型別為陰性，故動力實驗并不能很好地區分蕈狀和蠟樣。根狀生長實驗在區分二者上意義重大，本次實驗標準菌株和實驗室隨機選取的實驗株更具有代表性，為實驗室提供一定的理論基礎。

近年來，蠟樣芽胞桿菌食物中毒比例較高，常見此菌檢出自米面、谷物、肉制品等富含碳水化合物的食品[5]。實驗室可以選擇合適的平板，以提高工作效率。本次實驗優化了培養條件，由圖1 可見，經24 h 培養后，在PCA 平板上，LY 的山谷狀生長及XZ的根狀生長并不明顯，極個別可粗略判斷結果，在其他3 種培養基上，XZ 毛刺未長出，且LY 沿線生長，無山谷狀現象，可能與培養時間不夠，菌數達不到擴展生長量有關；經48 h 后，PCA 平板優勢顯現出來，尤其是XZ 毛須初形成，但與LY 的波狀紋相似，主觀判斷不肯定；經72 h 后，菌落形態見圖3、圖4、圖5、圖6，經觀察，XZ 的根狀現象和LY 的山谷狀能明顯區分，尤其XZ 根狀多而細長，在平板厚度相同條件下，不同培養基PCA ＞NA ＞TSA ＞TSA-YE；由72 h培養的圖片顯示，同一平板不同量區別很大，但9 mL和12 mL 在PCA 和NA 上因僅3 mL 體積差，對厚度的改變不大，效果尚可，其中以9 mL 最明顯，平板厚度9 mL ＞12 mL ＞15 mL ＞18 mL ＞20 mL。因此，實驗室在用根狀生長區分蠟樣和蕈狀時，可傾注9 mL的PCA 經干燥表面水分后在30 ℃培養72 h，非常容易區分根狀生長和山谷狀生長，且XZ 判為LY 的假陽性率極低（20 株/20 株，0%），注意培養時間不能超過72 h，否則平板易干燥開裂，不利于結果觀察。當基層實驗室未儲備PCA 時，可按照GB 4789.14 2014使用NA 平板，但培養時間可延長至72 h（國標為24 ～48 h），且瓊脂的量控制在9 mL。當儲備PCA 時，該實驗可首選PCA，從而提高檢出率，降低假陽性率，為蠟樣芽孢桿菌引起的食源性突發事件處置提供一定的參考。