一種酶系缺陷型醬用曲種的篩選、擴(kuò)培及應(yīng)用

◎ 陳 執(zhí)

（廣東美味鮮調(diào)味食品有限公司，廣東 中山 528400）

黃豆醬是我國傳統(tǒng)的調(diào)味醬，通常是以黃豆、面粉為原料，將黃豆炒熟磨碎后經(jīng)過米曲霉等微生物發(fā)酵而制成的一種更容易被人體消化吸收的半流動(dòng)狀態(tài)的發(fā)酵調(diào)味食品?，F(xiàn)有的黃豆醬在生產(chǎn)及貯藏過程中，經(jīng)常出現(xiàn)形狀不規(guī)則的白色結(jié)晶，俗稱白點(diǎn)，并且隨著黃豆醬商品貨架期的延長(zhǎng)，白點(diǎn)還會(huì)有增多的趨勢(shì)，嚴(yán)重影響黃豆醬成品的外觀。因此，黃豆醬白點(diǎn)問題成為行業(yè)亟待解決的難題。

黃豆醬釀造用主力菌種為米曲霉，其在制曲過程中分泌大量的蛋白質(zhì)水解酶系，大豆蛋白在蛋白酶的作用下水解成小分子肽，進(jìn)而分解為多種氨基酸和少量短肽，其中含有酪氨酸末端的肽鏈會(huì)在酪氨酸羧肽酶的作用下生成酪氨酸。因游離的酪氨酸難溶于水，當(dāng)酪氨酸超出水的溶解度時(shí)就會(huì)先析出微小的晶核，隨著蛋白質(zhì)水解酶系的催化和水解，釋放出更多的酪氨酸，使析出的晶體逐漸增大，累積形成肉眼可見的白點(diǎn)。本文通過篩選產(chǎn)游離酪氨酸肽酶的缺陷型菌株，降低黃豆醬發(fā)酵過程中游離酪氨酸含量，進(jìn)而抑制白點(diǎn)的析出。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

釀造黃豆醬生產(chǎn)原料黃豆、面粉、食鹽從市場(chǎng)采購；米曲霉As3.951，由廣東美味鮮調(diào)味食品有限公司提供。

超凈工作臺(tái)、培養(yǎng)箱、種曲機(jī)、NK 式旋轉(zhuǎn)蒸煮鍋、發(fā)酵池和60 m3發(fā)酵罐等。

1.2 方法

1.2.1 酶系缺陷型醬用菌株的篩選

從菌種庫中選取20 株不同的米曲霉菌株，以黃豆醬常用曲精為對(duì)照組，將20 株米曲霉試管菌種轉(zhuǎn)接三角瓶中，35 ℃培養(yǎng)72 h。取1 g 三角瓶菌種，加99 g面粉，混合均勻，制作成菌種粉，再將100 g 熟豆、10 g 面粉和8 g 菌種粉置于1 L 三角瓶中，混合均勻，放置在濕度為100%、溫度為35 ℃培養(yǎng)箱中，充分吸附面粉，最后將充分吸附面粉的黃豆，放在濕度為100%、溫度為30 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)44 h[1]。大曲成熟后，送檢大曲的中性蛋白酶和酸性蛋白酶活力[2-3]，選取其中中性蛋白酶活力明顯低于酸性蛋白酶活力的大曲作為目標(biāo)菌種，跟進(jìn)游離酪氨酸指標(biāo)。

1.2.2 酶系缺陷型醬用菌株發(fā)酵關(guān)鍵參數(shù)的驗(yàn)證

將上述20 株成熟大曲充分搖散，稱重。與306 g濃度為25%的鹽水混合，補(bǔ)水至600 g，制成醬醪，在培養(yǎng)箱中30 ℃發(fā)酵10 d，每天攪拌，發(fā)酵完成后，送檢醬豆的游離酪氨酸、生醬油理化指標(biāo)，確認(rèn)上述目標(biāo)菌種的游離酪氨酸指標(biāo)是否明顯低于其他菌株[4]。其中，篩選出中性蛋白酶活力明顯低于酸性蛋白酶活力，且游離酪氨酸指標(biāo)較低的菌種作為酶系缺陷型醬用菌種，進(jìn)入中、大試驗(yàn)證。

1.2.3 米曲霉中、大試降酪氨酸效果驗(yàn)證試驗(yàn)

（1）種曲培養(yǎng)基制作。選用干凈無雜質(zhì)的麩皮，按麩皮∶水∶面粉=1 ∶1 ∶0.2 的配方，將麩皮加至拌料機(jī)內(nèi)，加入對(duì)應(yīng)比例的自來水，攪拌1 min，停機(jī)。潤(rùn)水5 min 后，均勻撒入相應(yīng)比例的面粉，攪拌2 min，倒出，均勻鋪于曲盤中，送入種曲機(jī)內(nèi)，121 ℃滅菌30 min。

（2）種曲培養(yǎng)。滅菌好的培養(yǎng)基，接種篩選出的酶系缺陷型醬用菌種，接種量5‰。接種后，按以下工藝進(jìn)行種曲擴(kuò)大培養(yǎng)。①0 ～30 min 只開風(fēng)機(jī)，風(fēng)機(jī)頻率30 Hz，30 min 后關(guān)閉風(fēng)機(jī)。②0.5 ～6.0 h 打開罐體排污閥，一直通氣，通氣量為6 m3·h-1，控制料溫為30 ～34 ℃。③6 ～14 h 加濕10 min·h-1（隔一小時(shí)加濕10 min，下同），一直通氣，通氣量為6 m3·h-1，料溫為30 ～34 ℃。④14 ～18 h 加濕10 min·h-1，一直通氣，通氣量為10 m3·h-1，料溫為30 ～34 ℃。⑤18 ～46 h，連續(xù)通氣、加濕，通氣量為10 m3·h-1，控制料溫為30 ～34 ℃。⑥46 ～54 h 加濕30 min·h-1，連續(xù)通氣，通氣量8 m3·h-1，料溫為30 ～34 ℃。⑦60 ～72 h，連續(xù)通氣，通氣量6 m3·h-1，料溫28 ～30 ℃，培養(yǎng)種曲72 h 得到成熟的種曲。送檢培養(yǎng)成熟的種曲，測(cè)定其中性蛋白酶和酸性蛋白酶活力。

1.2.4 酶系缺陷型醬用菌株降酪氨酸效果驗(yàn)證

篩選出低產(chǎn)酪氨酸的米曲霉，與黃豆、面粉進(jìn)行混合制曲，接種量為5‰，制曲時(shí)間為42 ～44 h；送檢成熟大曲的中性和酸性蛋白酶活力；成熟大曲與17 Bé 的鹽水按照1 ∶2.5 的比例制醪，發(fā)酵罐進(jìn)行曬露發(fā)酵[5-6]，以黃豆醬常用大曲S1 為對(duì)照，按生產(chǎn)規(guī)模驗(yàn)證菌株降酪氨酸的效果。

1.2.5 指標(biāo)測(cè)定方法

醬豆中的中、酸性蛋白酶的活力按《蛋白酶活力測(cè)定法》（SB/T 10317 1999）測(cè)定；總酸按《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中總酸的測(cè)定》（GB 12456 2021）測(cè)定；氨基酸態(tài)氮按《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中氨基酸態(tài)氮的測(cè)定》（GB 5009.235 2016）測(cè)定；酪氨酸按《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中氨基酸的測(cè)定》（GB 5009.124 2016）測(cè)定；鹽分按《醬油衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)的分析方法》（GB 5009.39 2003）測(cè)定。

2 結(jié)果與分析

2.1 酶系缺陷型醬用菌株的篩選

由表1 可知，本輪共篩選了菌種庫中的20 株米曲霉菌株，與對(duì)照菌種（曲精）相比，米曲霉菌株M13的中性蛋白酶活低于對(duì)照菌株，酸性蛋白酶活略高于對(duì)照菌株，且酸性蛋白酶活力遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于中性蛋白酶活[7-8]。由表2 可知，M13 菌株釀造醬胚的游離酪氨酸生成率遠(yuǎn)低于對(duì)照菌種，且氨基酸態(tài)氮亦可滿足黃豆醬的需求，將該菌株進(jìn)行大試效果驗(yàn)證。

表1 大曲中性和酸性蛋白酶活力表 單位：U·g-1

表2 生醬油理化及醬豆游離酪氨酸表

2.2 酶系缺陷型醬用菌株大試規(guī)模性能驗(yàn)證結(jié)果

由表3 和表4 可知，篩選出的米曲霉M13 菌株制得大曲的中性蛋白酶活力遠(yuǎn)低于對(duì)照組。將其成熟大曲按照黃豆醬發(fā)酵工藝進(jìn)行發(fā)酵，檢測(cè)不同發(fā)酵時(shí)間醬胚的理化指標(biāo)及游離酪氨酸含量可知，發(fā)酵60 d 醬胚中的游離酪氨酸含量為38 mg/100 mL，遠(yuǎn)低于黃豆醬白點(diǎn)析出的警戒線（內(nèi)部試驗(yàn)多次驗(yàn)證結(jié)果為100 mg/100 mL），大大降低了產(chǎn)生白點(diǎn)的風(fēng)險(xiǎn)，該菌株能穩(wěn)定降低醬豆中游離酪氨酸。

表3 目標(biāo)菌株和對(duì)照菌種制得大曲的中性和酸性蛋白酶活力對(duì)比表 單位：U·g-1

表4 發(fā)酵不同時(shí)間對(duì)照樣和試驗(yàn)樣醬胚的理化指標(biāo)對(duì)比表

3 結(jié)論

從菌種庫中篩選出低中性蛋白酶活、低游離酪氨酸產(chǎn)率的酶系缺陷型米曲霉菌株，經(jīng)黃豆醬發(fā)酵確定了低游離酪氨酸產(chǎn)率的酶系缺陷型的米曲霉菌株的應(yīng)用效果，該菌株能滿足醬豆中低產(chǎn)酪氨酸的需求、性能穩(wěn)定。