基于敏感肌形成機制的舒緩成分評價方法研究

袁春穎，韓婷婷，李 燕，姜姍姍，劉三嶺，冷佳蔚，楊素珍*

（1. 山東福瑞達生物股份有限公司，山東 濟南 250101；2. 山東省食品藥品檢驗研究院，山東 濟南 250101）

敏感性肌膚是一種特殊的皮膚類型，不屬于皮膚病的范疇。敏感肌易出現皮膚干燥、泛紅、脫屑、紅斑、丘疹、腫脹、膿包、水皰、毛細血管擴張等客觀癥狀，同時也易出現瘙癢、刺痛、灼燒、緊繃等主觀癥狀；更有甚者，當皮膚敏感情況嚴重時，也可能出現負面情緒或精神癥狀。根據世界衛生組織調查，皮膚敏感已成為皮膚的一種常態，亞洲女性中敏感性肌膚人群比例已超過50 %[1]；在全球范圍內，有高達71 %普通成年人發生某種程度的肌膚敏感，而40 %人群有中度或重度的肌膚敏感[2-3]。

敏感肌的產生是一個復雜的過程，由外而內涉及皮膚表面的微生態屏障、表皮屏障、神經系統和炎癥反應等多個方面，改善敏感肌常需通過皮膚護理、調整生活習慣、避免接觸刺激源等方式緩解或避免。目前市面上用于改善肌膚敏感的原料和護膚產品眾多，效果也參差不齊，因此，建立全面有效的功效評價體系是一項亟待完善的工作。本文從敏感肌的形成機制出發，介紹了包括細胞、3D模型、動物和人體等4個維度上的功效靶點和檢測方法，為舒緩、抗敏感功效成分的研發提供科學依據和理論基礎。

1 皮膚敏感機制

1.1 基于微生態失衡的皮膚敏感機制

皮膚是人體最大的器官，其表面環境與微生物群落組成的微生態系統構成了皮膚的第一道屏障[4-5]，微生物群落的組裝、穩定和功能的執行由宿主和微生物之間相互作用來驅動。當皮膚微生物群與宿主和外部環境平衡穩定時，皮膚表現為健康狀態；若皮膚微生物群與宿主和外部環境失衡時，皮膚屏障受損，則出現各種皮膚問題[6-7]。如在特應性皮炎（AD）患者的皮膚中檢測出金黃色葡萄球菌的豐度更高，表皮屏障受損更嚴重，白介素4（IL-4）、白介素13（IL-13）、白介素22（IL-22）、胸腺基質淋巴細胞生成素（TSLP）和其他與AD相關的細胞因子的表達升高[6]，加劇皮膚炎癥。因此，穩定皮膚微生態，是改善敏感肌的一大重要關注點。

1.2 基于表皮屏障功能受損的皮膚敏感機制

狹義上的皮膚屏障一般指表皮層，尤其是與角質層結構相關的屏障功能，干燥、脫屑等癥狀均是敏感肌膚最直接的表現。其原因主要是外界刺激后，角質細胞排列錯亂，細胞間基質成分破壞降解，角化包膜不能正常形成，導致角質層結構改變，通透性增加、水分的維持能力受損、屏障功能異常。表皮屏障功能受損不僅與特應性皮炎、銀屑病、黃褐斑、痤瘡等疾病[8]的發生密切相關，同樣也是敏感肌形成的重要原因，因此，為改善皮膚的敏感情況，需著重關注皮膚表皮屏障功能的損傷及修復情況。

表皮層形態及結構的完整是發揮屏障功能的基礎，任何結構受損均直接或間接導致敏感肌或加重敏感癥狀。何黎等[9]構建了長鏈非編碼RNA（lncRNA）和信使RNA（mRNA）的共表達網絡，通過全基因組測序篩選敏感肌膚與非敏感肌膚的差異基因，發現IncRNA LNC 000265這一的差異化最大，它與編碼緊密連接蛋白5的序列具有高度相關性，緊密連接蛋白5在真表皮連接處發揮至關重要的作用；兜甲蛋白、外周蛋白和富含脯氨酸的小蛋白在轉谷氨酰胺酶1，3和5的催化下與神經酰胺發生交聯，形成角化包膜，保護和防止水分流失[10]；絲聚蛋白在角質細胞從顆粒層向角質層過渡的過程中，被多種酶（如基質蛋白酶、弗林蛋白酶、成對氨基酸轉化酶-4）去磷酸化，聚集角蛋白的中間細絲，形成最外層的角質屏障[11]；除此之外，內膜蛋白水通道蛋白3可在細胞膜上形成“孔道”，像細胞的“水泵”一樣控制水的進出[12]。表皮屏障的正常功能不僅依賴于其正確的形態結構，還需有充足且完整的生化成分。透明質酸是細胞外基質的最大成分，具有非常強的水結合能力；皮膚中天然存在的神經酰胺可形成防水屏障，減少水分流失，而神經酰胺鏈長度減少對角質層的滲透性有很大的負面影響，特應性皮炎患者中有觀察到神經酰胺鏈長度減少[13-14]。

1.3 基于神經反應的皮膚敏感機制

敏感皮膚中的感覺受體在接觸到外界刺激時，經神經末梢與神經元的逐級信號傳遞，最終在大腦皮層形成疼痛、瘙癢等感覺，若皮膚的神經反應性過于敏感，感覺受體表達異常，均有可能導致皮膚敏感。Misery等[15]發現瞬時受體蛋白（TRP）的激活與Ca2+調控通道密切相關，非興奮細胞外的Ca2+濃度低，膜內外濃度差小，便無法形成感受電位，當受到刺激時，Ca2+內流，膜內外濃度差變大，產生動作電位，神經遞質傳遞從而介導疼痛等神經變化。刺激源不同會激活不同的瞬時性受體電位通道（TRPV），從而傳遞不同的神經信號：辣椒素或熱源可激活辣椒素受體（TRPV1）[16]，傳遞熱感或灼燒感；激活瞬時性受體電位通道4則引起瘙癢與疼痛感[17]；TRPM8主要傳遞冷感[18]。臨床試驗結果表明，敏感肌膚的表皮內神經纖維的數量明顯減少，C纖維和Aδ纖維群也發生了改變[15,19]。

1.4 基于炎癥反應的皮膚敏感機制

與正常皮膚相比，敏感性皮膚對外源性刺激和過敏原的攻擊防御能力相對較差，很容易因刺激或過敏而產生一系列炎癥反應[20]。據報道，美國兒童和成人群體中AD的流行率分別為11.3 %～12.7 %和6.9 %～7.6 %[21]。白介素（IL）是白細胞或免疫細胞間相互作用的最主要淋巴因子，參與不同的信號通路調控各類生理活動。IL-14和IL-13 兩型細胞因子能促進趨化因子的產生、誘導皮膚屏障功能障礙、抑制抗菌肽的表達[22-23]；IL-31可促進腦源性利鈉肽的產生和釋放，調控致炎因子和趨化因子釋放，誘導AD患者的瘙癢感[24]；IL-17能減少絲聚蛋白和外披蛋白的表達，加劇皮膚的屏障損傷[25-26]。區別于T淋巴細胞產生的多種細胞因子，IL-33是在皮膚遭受感染、炎癥或損傷時由各種組織的駐留細胞產生，通過影響造血干細胞的功能引發炎癥，與非炎癥皮膚相比，AD患者皮膚中IL-33的表達水平大幅升高[27]。

2 改善敏感肌成分的評價方法研究

2.1 基于微生態平衡的改善敏感肌成分的評價方法

目前在化妝品中人為干預或調控皮膚微生態平衡、增加菌群多樣性的方法主要是添加應用發酵技術開發的益生菌、益生元、后生元和合生元等，屈暢[28]指出對微生物的菌群豐度及多[29-30]樣性進行檢測是反映化妝品原料干預效果最直觀的評價形式?；诟纳破つw微生態的原料評價思路可概括為采樣-檢測-分析3個階段。常用的采樣手段主要有無菌棉簽擦拭皮膚進行大規模采樣、膠帶粘取或剝脫收集表層皮膚樣本、針孔穿刺取樣等[30]。對于菌群的檢測手段經歷了從凝膠平板技術和低聚糖生物選擇性技術到DNA測序技術的精確性跨越。通過凝膠平板培養活菌菌落，對其進行分離、計數和鑒定是傳統的培養方法，但是受限于實驗室條件不能完美復原或實現菌種的最優生長環境，可實現體外培養的菌種有限；房曉[29]用大多數共生菌群均能利用低聚糖做為碳源，利用致病菌群則沒有代謝低聚糖能力的這一特性，對基體中碳殘留量進行對比，間接反映共生菌與致病菌的生存及定殖情況，但它僅能依據低聚糖的種類將菌種的范圍鑒定在屬水平。DNA測序技術彌補了以上兩種方法的缺陷，傳統的測序方法如擴增子測序，利用保守的基因序列進行擴增，通過擴增循環數間接反映含量變化，如細菌多采用16S核糖體RNA（16S rRNA），真菌則優選內部轉錄間隔區1（ITS1）為各自的保守序列進行擴增[31-32]，根據擴增子的測序分析可確定屬和物種水平的群落組成及變化。近年，隨著重大技術和分析方法突破，利用鳥槍法宏基因組測序成為可能，不需靶向序列擴增，且不需對特定目標區域進行測序，即可同時捕獲包括人類、細菌、真菌、古細菌和病毒樣本中的所有遺傳物質[33-36]，揭示其在界和菌株水平上的相對豐度。

2.2 基于表皮屏障功能的改善敏感肌成分的評價方法

針對表皮屏障功能相關的靶點，可在人體、離體皮膚、皮膚外植體、3D全層皮膚模型、3D表皮模型及2D細胞上進行不同維度的生物及化學方法檢測?；陔x體皮膚、皮膚外植體、3D全層皮膚模型、3D表皮模型，可直觀地在顯微鏡下觀察角質細胞排列狀況判斷屏障結構的完整性，在此基礎上升級的蘇木精-伊紅（HE）染色法，通過顏色變化可更為直觀地觀察到角質層厚度變化及角質形成細胞的活性。對于各個靶標蛋白的檢測方法則更多元化，如對某一目標蛋白進行特異的熒光染色，目前常用的標記染料如FITC、GFP等，根據其熒光面積及強度分析目標蛋白的表達是否增加；蛋白免疫印跡技術（western blotting）可在提取的總蛋白中特異性標記出目的蛋白，通過比較目的蛋白的灰度即可判斷相應蛋白的表達量，與此原理相似的方法還有酶聯免疫吸附測定（ELISA），同樣可精準識別并定量總蛋白中的特異性目的蛋白。通過滲透實驗，根據熒光染料進入皮膚模型的情況確定表皮的通透性，若進入模型的染料增多，則皮膚的通透性增大。基于透明質酸鈉、神經酰胺、長鏈/短鏈脂肪酸、天然保濕因子等細胞間各生化成分的檢測，可采用紫外檢測、高效液相色譜和液質聯用[37-38]等方法；雷曦利用ATP或底物剩余量的酶促反應動力學實驗檢測透明質酸酶的抑制率，其抑制率越高，屏障修護功效越強[39]。

離體皮膚資源較難獲得，皮膚外植體及3D皮膚模型的普及和使用難度較高，基于2D細胞層面的功效評價較容易實施與開展。在2D細胞層面，通過噻唑藍（MTT）比色法、Cell Counting Kit-8（CCK-8）、中性紅染色等常規方法檢測細胞活性與增殖情況；通過細胞劃痕實驗檢測細胞的遷移率，多角度驗證功效成分對皮膚特征性細胞的直接作用。收集功效成分干預后的細胞，破碎提取其總蛋白，利用Western Blotting、特異性熒光染色、ELISA等方法繼續特定蛋白的表達檢測，同時還可裂解細胞提取總RNA，用實時熒光定量PCR方法進行基因層面的分析與檢測。

在人體維度，除了借助調查問卷通過消費者的自我評估獲得相應數據外，還可借助儀器測量獲取直觀數據，如皮膚水分測試儀（corneometer）可檢測功效成分使用前后皮膚含水量的變化，VISIACR可對采取面部成像進行紅區的a*值分析；經皮水分散失值（TEWL）則可利用經皮水分散失測試儀（如aqua flux）獲得。

2.3 基于神經反應的改善敏感肌成分的評價方法

對具有神經舒緩功效的成分進行評價時，可從神經鎮靜的角度出發，鎮靜效果越好，則舒緩功效越強，主要思路是通過比較原料作用前后相關神經纖維的密度、受體蛋白的表達或激活水平及Ca2+電位變化進行評估，其神經纖維的密度越接近于正常肌膚，感覺受體蛋白的激活與表達數量越少，Ca2+的內流情況得到抑制，則舒緩功效越強。

劉棟等[40]借助Ca2+選擇性微電極進行穿刺，檢測內充液在細胞內外的電位差，檢測功效成分的舒緩功效；劉麗娜等[41]用放射性同位素標記Ca2+，檢測含量變化；劉麗娟等[42]用Fura2、Indol、Fluo-4AM等熒光指示劑標記Ca2+，通過流式細胞儀、熒光分光光度計或熒光顯微鏡聯合檢測Ca2+變化。針對受體表達方面，Scandolera等[43]開發了正常人星形膠質細胞的炎癥模型模擬敏感皮膚中與神經炎癥相關的疼痛感應，并證實紅色微藻提取物中的γ-氨基丁酸（GABA）及其結構衍生物GABA-丙氨酸能抑制TRPV1的表達，緩解敏感；Zhou等[44]利用角質形成細胞的炎癥模型發現柑橘果實提取物能通過抑制TRPV1激活，緩解辣椒素、乳酸、苯氧乙醇等引發的神經高反應，增強皮膚的耐受性。

2.4 基于炎癥反應的改善敏感肌成分的評價方法

炎癥導致皮膚的血管增生、口徑增大，斑馬魚炎癥誘導試驗可用于觀察降低炎癥因子IL-6和腫瘤壞死因子α（TNF-α）的表達后血流速度與血管口徑的變化[45]；此外，小鼠實驗表明痔九味鎮痛膏能有效抑制皮膚毛細血管通透性增加，對祛腫功效評價有一定借鑒意義。在炎性滲出過程中，白細胞通過黏附因子與內皮細胞先發生粘連游出，然后在趨化因子和細胞因子的牽引下向炎區移動，因此黏附因子、趨化因子的表達情況也間接反映了白細胞的流出與趨化情況。潘虎[46]通過培養體外鼻息肉和皮膚組織，檢測到組胺和花生四烯酸能誘導單核細胞趨化因子蛋白-1（MCP-1）、單核細胞趨化因子蛋白-3（MCP-3）、活化后可調節的正常T細胞表達分泌因子（RANTES）等趨化因子和IL-4、IL-5和TNF-α的表達，導致炎癥的發生；5-脂氧合酶（5-LOX）及環氧合酶1/2（COX1/2）不僅是花生四烯酸代謝的主要動力酶，同樣也是各種舒緩成分的主要作用靶點，花生四烯酸會通過5-LOX介導的脂質氧化酶途徑和 COX-1/2介導的環氧化酶途徑分別生成白三烯和前列腺素，吳丹丹[47]通過二氧化鈦納米管固定酶篩選出忍冬中的槲皮素、木犀草素、忍冬苷等10種化合物對5-LOX具有較好的抑制功效。由于抗原呈遞細胞數量和形式的限制很難在體外培養，因此用CD54/CD86在人急性單核細胞白血病細胞系（THP-1）上的表達增加作為等效替代指標[48]。通過比較THP-1上CD54/CD86的相對熒光強度（RFI）的影響程度，判斷其作用效果：在THP-1細胞的存活率大于50 %的前提下，如果RFICD86≥150或者RFICD54≥200，則表示有促炎作用。

除此之外，針對各類白介素的檢測也是舒緩功效成分的主要檢測靶點。Johnston等[49]通過轉錄組及差異基因富集分析發現IL-1和IL-36是廣泛性膿皰型銀屑病的主要細胞因子，戰紫瑩通過酶聯免疫吸附法、HE染色、免疫熒光染色等實驗證實菊科植物木香中的木香烴內酯可抑制IL-36[50]介導的銀屑病樣皮膚炎癥；包括阿達木單抗、英夫利昔單抗、依那西普、賽妥珠單抗和戈利木單抗在內的TNF-α抑制劑[51]，能很好地抑制AD的發生。

3 展望

敏感皮膚形成原因包括微生態屏障失衡、表皮屏障功能受損、神經反應敏感及炎癥反應。本文將抗敏感活動分為四步評價法：維持微生態平衡能力、表皮屏障修復能力、神經鎮靜能力和抗炎能力；按照上述分類，在進行舒緩成分的功效評價工作時，分別通過體外細胞、3D皮膚模型、動物或相應的人體實驗進行篩選和改進，以建立系統的基于敏感皮膚產生機制的原料評價方法，為篩選出更好的改善皮膚敏感的化妝品原料提供科學的依據及理論基礎。

然而，在皮膚微生態、神經因素及抗炎能力的評價方法方面，目前有很多細胞因素及其生理功能尚未分析完全，各種體外培養的人體皮膚細胞和3D皮膚模型無法完全還原機體的變化情況，因此，我們仍需要從多方面、多層次繼續探索分析敏感皮膚的成因，尋找更加合適的抗敏感成分的功效評價方法，建立更加完善的評價體系。