核桃肽的制備、分離純化及生物活性研究進展

李溢真 ，陳 勉 ，袁丹丹 ，牛林林 ，袁嘉麗，陳 磊 ， 馬學彬 ，王傳金 ，孔令斌 ，尉 茜 ，劉 飛 *

（1. 山東省藥學科學院 山東省生物藥物重點實驗室 山東省多糖類藥物工程實驗室 多糖類藥物發酵與精制國家地方聯合工程實驗室 博士后科研工作站，山東 濟南 250101；2. 山東省生物醫藥科學院有限公司，山東濟南 250101；3. 云南中醫藥大學 云南省中醫藥分子生物學重點實驗室，云南 昆明 650500）

核桃（Juglansmandshurica）原產于東亞、北美和歐洲東南部，在我國種植廣泛[1]。核桃富含不飽和脂肪酸、蛋白質、多酚和礦物質[2]，具有抗氧化[3]、抗腫瘤[4]、抗炎[5]、降低膽固醇[6]、降低血壓和心血管疾病風險的作用[7]。核桃仁的脂質含量高達74 %，可加工成核桃油，但下腳料核桃粕卻未被合理利用。據報道，核桃粕中約45 %為蛋白質，含有18種氨基酸，其中8種必需氨基酸的含量能滿足人體需要[8]。生物活性多肽由2～20個氨基酸通過肽鍵連接而成，主要由動物或植物的食物蛋白，通過酶解、發酵或體內體外消化獲得[9]。近年，有研究利用不同技術由核桃粕（蛋白質）制備并分離純化具有抗氧化、抗高血壓、免疫活性和神經活性的核桃肽。核桃肽作為一種新型核桃粕深加工產品，具有廣闊的應用前景和市場潛力。

1 核桃肽的制備

從植物中制備活性多肽的方法有酶法、發酵法和化學法等。化學法通過酸或堿催化水解蛋白質，產生活性肽。反應過程較難控制，環境友好性低，不適合產業化。目前，制備核桃肽主要采用酶法和發酵法。

1.1 酶法制備

常用的核桃蛋白水解酶有胃蛋白酶[10]、胰蛋白酶[11]、堿性蛋白酶[12]、木瓜蛋白酶[13]、中性蛋白酶[14]、復合蛋白酶（胰酶）[15]等。酶具有特異性、高效性、專一性等特點，酶的種類、pH、溫度、酶解時間、酶活性、料液比和酶底物比等條件對于酶法制備核桃肽至關重要。

利用堿性蛋白酶酶解核桃肽，酶解工藝不同，制備的效果也不同。弘子姍等[16]通過四因素三水平正交試驗，加酶量為300 U/ml、pH 10、酶解溫度50 ℃、酶解3.5 h，多肽得率為80.34 %。張研彥等[17]酶解工藝條件為溫度50 ℃、pH 9、加酶量3.0 %、酶解時間5.0 h，水解度達22.63 %，多肽得率為88.24 %。張慶[18]等通過Box-Behnken中心組合試驗表明，酶解最佳工藝條件為酶解溫度50.24 ℃、加酶量2.03 %、pH 7.13、酶解時間4.2 h，得到多肽質量濃度為2.55 mg/ml。馬開創[19]利用酶水解結合堿溶酸沉法，酶解溫度50.0 ℃、pH 9、加酶量3.0 %、酶解時間5.0 h；在此條件下，水解度為22.63 %，多肽得率為88.24 %。木瓜蛋白酶、胃蛋白酶也常用來制備核桃肽。王攀等[13]研究表明，當木瓜蛋白酶酶解溫度為60 ℃、酶解時間為3.5 h、底物濃度為2.5 g/100 ml、加酶量為6500 U/g、pH為6.5時，酶解物的抗氧化活性較好。侯雅坤[20]研究表明，木瓜蛋白酶酶解溫度50 ℃、料液比1:25、pH 6.0、加酶量3 %、酶解時間4 h，最終得水解度15.63 %酶解液；胃蛋白酶酶解溫度55 ℃、料液比1:20、pH 3.0、加酶量4 %、酶解時間4 h，最終得水解度15.72 %酶解液。

1.2 發酵法制備

通過發酵生產生物活性肽，不僅降低生產成本，還能在發酵過程中對蛋白質原料起到解毒去苦作用。目前發酵方法有兩種：固體發酵和液體發酵。

劉瀟等[21]對比枯草芽孢桿菌（Bacillussubtilis10160）和黑曲霉（GIM3.452）固態發酵制備核桃粕多肽的生產性能，篩選最優發酵條件參數，相對分子質量（Mr）分布測定結果表明，枯草芽孢桿菌固態發酵制備核桃粕多肽產量高于黑曲霉。許典等[22]將核桃粕烘干脫脂制成核桃粕粉末后，用黑曲霉液態發酵制備核桃肽液，過濾去雜質，冷凍干燥制得核桃肽粉。高瑞雄等[23]用納豆芽孢桿菌（Bacillussubtilsnatto）進行液態發酵，發酵時間84 h、底物質量濃度0.08 g/ml、起始pH 8.0、接種量11 %、發酵溫度33 ℃時，核桃肽質量濃度2.58 mg/ml，水解度37.5 %，均達最大值。賀瑩等[24]用乳酸菌液態發酵，進行三因素三水平的響應面綜合分析，得最優工藝參數：超聲功率156 W、發酵溫度42.3 ℃、發酵時間9.9 h；在此條件下，核桃肽質量濃度為2.88 mg/ml。王瑞珍[25]利用納豆芽孢桿菌分別與戴爾凱氏有孢圓酵母（Torlaspora delbrueckii）和植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）混合固態發酵核桃粕，發酵60 h后，多肽含量分別達到了2.49 %和4.03 %。

2 核桃肽的分離純化

通過酶法或發酵法制得的核桃蛋白水解物由不同Mr的活性肽、大分子蛋白、固體雜質和可溶性雜質組成。在研究和生產中，通過對目標產物進行分離純化獲得活性成分含量更高、純度更高的核桃肽。膜分離技術（超濾法）和色譜技術廣泛用于核桃肽的分離和純化。

2.1 超濾法

核桃肽分離純化的第一步通常是超濾。 核桃蛋白水解液在壓力驅動下通過一定孔徑的超濾膜，核桃肽因其粒徑較小而能順利通過超濾膜，而Mr較大的不溶物、酶和蛋白質則留在膜外，從而達到初步純化的目的[26]。 初步純化的核桃肽可依次通過不同孔徑的超濾膜，完成不同范圍Mr多肽的分離[27]。 然而，用超濾技術很難有效分離Mr很小或相似的多肽。 因此，在實際研究中，常與色譜技術相結合。

2.2 色譜法

核桃肽分離純化的第二步為色譜法，較常用的色譜方法有凝膠滲透色譜 （GPC）、離子交換色譜 （IEC）、高效液相色譜 （HPLC）、反相高效液相色譜法 （RP-HPLC）和金屬親和色譜法（MAC）[28]。

上述方法各有優缺點， 單一的技術無法完全、高效的分離純化核桃肽。 因此，在實際操作過程中，需綜合考慮核桃肽的多種性質，采用多種方法組合技術對其進行分離純化，以達到更好的分離純化效果 。

3 核桃肽的生物活性

3.1 抗氧化活性

人體內氧化產生的自由基與人體衰老和多種疾病有關[29]。丁基羥基茴香醚（BHA）、二丁基羥基甲苯（BHT）等化學合成的抗氧化劑因其毒副作用，不利于人體健康[30]。李敏等[31]用超聲輔助提取核桃蛋白，用中性蛋白酶酶解核桃蛋白后制備的核桃肽提取液，對超氧陰離子自由基的清除率達58.27 %，對羥基自由基的清除率達71.92 %，對DPPH自由基的清除率達68.93 %，抗氧化效果顯著。王魯黔[32]利用堿性蛋白酶制備的核桃肽，其DPPH和ABTS自由基清除能力與維生素C相當，具有較強的自由基清除能力。安傳相等[33]研究核桃肽清除·OH和DPPH自由基的IC50值分別為15.43和18.38 mg/ml，具有良好的抗氧化能力。慈傲特[34]制備的的核桃肽經超濾分級，Mr＜3000的多肽有較好的體外抗氧化活性和體內抗氧化活性，可提高小鼠血清、肝臟和脾臟中的超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）和谷胱甘肽過氧化物酶（GSHPx）活性，降低氧化產物丙二醛（MDA）的含量。該多肽進一步分離純化后得到抗氧化肽LAYLQYTDFETR，其濃度為0.1 mg/ml時，DPPH自由基清除能力、·OH清除能力和ABTS自由基清除能力分別為56.25 %，47.42 %和67.67 %。

3.2 降血壓活性

血管緊張素轉換酶（ACE）是一種二肽基羧肽酶，在腎素-血管緊張素系統和激肽釋放酶-激肽系統中起作用，導致血壓升高。ACE抑制肽可抑制ACE的活性，降低血管的張力、血容量和血壓，對調節人體血壓起重要作用。從食物蛋白中提取的ACE抑制肽可有效降低高血壓，但對正常血壓無影響，與降壓藥相比沒有副作用[36]。核桃粕酶解液中Mr小于10000的核桃肽對ACE抑制率較高，各組分IC50值表明，堿性蛋白酶酶解液和胃蛋白酶酶解液中Mr小于5000組分對ACE 抑制效果較突出[20]。以Alcalase酶酶解得到的核桃肽，色譜純化后ACE抑制率最高可達90.35 %，IC50值為0.158 mg/ml；通過液質聯用（UPLC-MALDITOF/MS）鑒定出兩種ACE抑制肽：Leu-Tyr（LY）和Tyr-Leu-Ala（YLA），其化學合成肽IC50值分別為42和396 μmol/L，均有較強的ACE抑制效果[12]。利用胃蛋白酶酶解核桃粕，并分離制備抑制肽粗品，高效液相色譜篩選活性較高的ACE抑制肽粗品，其IC50達0.2633 mg/ml[37]。經測序后，人工合成ACE抑制肽YVPHWNL，利用體外模擬胃腸消化實驗檢測其活性，得到消化前后ACE抑制肽的IC50值分別是0.1357和0.1732 μmol/ml。賈靖霖[38]通用堿溶酸沉法提取蛋白質，當酶解液的濃度達到0.081 g/10 g時，對ACE的抑制作用最強，表明核桃蛋白酶解物有降血壓活性。周慧江[39]用Alcalase 2.4L制備核桃蛋白酶解物，ACE抑制率為76.58 %，成分研究表明，疏水性氨基酸含量較高，對ACE抑制率有重要作用；超濾分離得到MWCO組分為Mr1000透過液組分，ACE抑制活性最高達78.43 % ，IC50為2.055 mg/ml；對MWCO進行脫鹽純化，ACE抑制率為80.73 %，IC50為1.65 mg/ml，降血壓活性顯著增強。

3.3 抗高尿酸活性

高尿酸血癥與高血壓、動脈粥樣硬化、胰島素抵抗和腎臟疾病密切相關，其發病率越來越高，嚴重影響人類生活質量[40]。通常用于治療高尿酸血癥的藥物有一定副作用。近年，一些食物源性具有優異黃嘌呤氧化酶抑制劑（XOI）活性的生物活性肽被廣泛關注。核桃粕水解物和脫酚核桃粕水解物（DWMH）均具有較好的XOI活性[41]，可有效降低高尿酸血癥大鼠的血清尿酸水平。從 DWMH 中成功分離純化出兩種新型抗高尿酸肽 WEPKDEX 和ADIYTE，Mr分別為 640.8和 710.7，IC50值分別為17.75和 19.01 mg/ml。Li 等[42]進一步研究核桃活性肽在體外的XOI活性和作用機制，發現含色氨酸的活性肽能有效抑制黃嘌呤氧化酶，且隨色氨酸量增加，含色氨酸多肽的XOI活性也顯著增強。與別嘌呤醇類似，色氨酸與黃嘌呤氧化酶的關鍵殘基如Glu802、Leu873等有正向相互作用，從而有效抑制黃嘌呤氧化酶的活性。蘇國萬等[43]公開了一種從核桃粕中制備具有降尿酸作用的生物活性肽的方法，此法制得的靶標生物活性肽可顯著降低大鼠血清肌酐水平，對大鼠腎功能有一定的保護作用，有顯著的降尿酸作用。

3.4 健腦益智活性

腦外傷、應激創傷、精神發育遲滯、柯薩可夫綜合征、阿爾茨海默病和一氧化碳中毒等疾病，可誘發學習和記憶功能障礙。現階段改善該障礙的藥物如多奈哌齊、鹽酸美金剛等均有明顯的副作用。核桃自古便有健腦益智作用的記載，近年大量研究表明，核桃肽能提高學習與記憶功能，有優越的健腦益智活性。

Morris水迷宮實驗結果表明[44]，核桃肽YVLLPSPK通過減輕氧化應激緩解認知缺陷。透射電鏡觀察小鼠海馬組織線粒體形態并進行Western blot和免疫熒光分析，結果表明，YVLLPSPK通過NRF2/KEAP1/HO-1通路與PINK1介導的線粒體自噬相關，改善了東莨菪堿所致認知功能障礙小鼠的學習記憶能力。核桃肽顯著提高學習記憶損傷小鼠模型血清中抗氧化酶（SOD 和 GSH-Px）含量，抑制腦組織中一氧化氮合酶（NOS）生成，顯著降低氧化產物（MDA 和 NO）含量，有效改善了小鼠對空間和有害刺激的學習記憶能力[45]。其中PW5 肽的抗 Aβ蛋白聚集活性最佳，具有預防阿爾茨海默病的潛質。核桃肽MWHP（Mr＜3000）對記憶障礙的抑制作用研究表明[46]，小鼠行為學實驗Morris水迷宮測試中，MWHP縮短東莨菪堿誘導小鼠到達終點時間，減少錯誤次數，增加到達終點的動物數量。 MWHP 還延長了被動回避響應測試中的潛伏期，并減少錯誤率。結果表明，MWHP（Mr＜3000）可抑制東莨菪堿引起的記憶障礙；在機制研究中，MWHP（Mr＜3000）通過減少氧化應激、抑制細胞凋亡、調節神經遞質功能、維持海馬CA3 錐體神經元和增加腦組織中鈣調蛋白依賴性蛋白激酶 II 水平，改善記憶。核桃肽對過氧化氫（H2O2）與β淀粉樣多肽蛋白（Aβ25-35）誘導的大鼠腎上腺嗜鉻細胞瘤（PC12）細胞的損傷有良好的保護作用，其神經保護作用的機制與提高PC12細胞的抗氧化能力有關；Morris水迷宮及電跳臺實驗證實了核桃肽顯著改善Aβ25-35小鼠的認知障礙和長期記憶的能力，具有健腦益智活性[47]。

4 結論與展望

核桃油作為優質功能油其年消費量逐年增加，其副產品核桃粕的產量也在逐年增加。核桃粕是一種優質的植物蛋白資源，卻被視為廢物或低價值飼料、肥料等材料。核桃粕的經濟利用不足在一定程度上阻礙了核桃產業的發展。有效利用核桃粕蛋白開發核桃蛋白產品，對于實現核桃綜合利用、提高副產品附加值、改變利用率低的現狀具有重要意義。