腎結石患者腎乳頭組織中LINC01197及相關因子的表達研究

林謙，倪建華，耿志海，朱江波，章慶華，鄭森中

·論 著·

腎結石患者腎乳頭組織中LINC01197及相關因子的表達研究

林謙，倪建華，耿志海，朱江波，章慶華，鄭森中

臺州市第一人民醫院泌尿外科，浙江臺州 318020

探討腎結石患者腎乳頭組織中LINC01197、miR-516b-5p、SIRT3、FoxO1、Ac-FoxO1的表達特點及相關性。選取2021年3月至2023年3月臺州市第一人民醫院收治的經皮腎鏡碎石術治療的30例草酸鈣腎結石患者作為結石組，選取同期行根治性腎切除術（術后均由病理科診斷為透明細胞癌）的30例腎腫瘤患者作為對照組。結石組于術中直視下活檢腎乳頭及其周圍間質組織，對照組收集遠離腫瘤（2cm以上）的正常腎乳頭組織樣本，經病理學診斷后確診為正常腎乳頭組織。檢測、比較兩組腎乳頭組織內LINC01197、miR-516b-5p、SIRT3、FoxO1、Ac-FoxO1表達水平，分析LINC01197、miR-516b-5p、SIRT3之間的相關性。與對照組相比，結石組的腎乳頭組織呈現LINC01197和SIRT3低表達、miR-516b-5p和Ac-FoxO1/FoxO1高表達，差異均有統計學意義（<0.05）。Spearman相關性分析顯示LINC01197與miR-516b-5p呈顯著負相關（=–0.751，<0.05），LINC01197與SIRT3呈顯著正相關（=0.813，<0.05），miR-516b-5p與SIRT3呈顯著負相關（=–0.528，<0.05）。LINC01197 在腎結石病理進展中具有潛在價值，其參與調節腎結石的發展可能跟miR-516b-5p、SIRT3、FoxO1 有關。

長鏈非編碼RNA；LINC01197；miR-516b-5p；FoxO1；腎結石

長鏈非編碼RNA（long-non coding RNA，lncRNA）在多層面參與調控基因的表達，影響機體的病理和生理過程，在細胞增殖、分化、凋亡中發揮重要作用[1]。近年來研究發現，在腎結石患者、腎結石動物模型或細胞模型中存在大量lncRNA異常表達[2-3]。LINC01197是被發現的lncRNA之一，其位于15q26.2，長度為1445個堿基，可能在腎結石病理進展中具有重要的研究價值。本研究采用分子生物學方法，檢測腎結石腎乳頭組織內LINC01197、miR-516b-5p、SIRT3、FoxO1、Ac-FoxO1表達水平，初步探討了腎結石患者腎乳頭組織中LINC01197及相關因子的表達特點。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2021年3月至2023年3月臺州市第一人民醫院收治的經皮腎鏡碎石術治療的30例草酸鈣腎結石患者作為結石組，選取同期行根治性腎切除術（術后均由病理科診斷為透明細胞癌）的30例腎腫瘤患者作為對照組。結石組于術中直視下活檢腎乳頭及其周圍間質組織，對照組收集遠離腫瘤（2cm以上）的正常腎乳頭組織樣本，經病理學診斷后確診為正常腎乳頭組織。結石組納入標準：①術后結石標本經紅外光譜自動分析系統分析結石成分主要為草酸鈣；②無痛風、冠心病、糖尿病、自身免疫性疾病、甲狀旁腺功能亢進等疾病；對照組納入標準：①所選病例無高尿酸血癥、糖尿病、泌尿系感染等其他的代謝性疾病；②患者既往無泌尿系結石病史；③年齡與結石組患者匹配。排除標準：有尿酸結石、感染性結石和胱氨酸結石等疾病。兩組性別、年齡比較，差異無統計學意義（>0.05），具有可比性。本研究經臺州市第一人民醫院醫學倫理委員會批準（倫理審批號：臺一醫倫審2022研第114號01），患者及家屬簽署知情同意書。

1.2 主要試劑

TRIzol試劑盒（上海Absin公司，貨號：abs9331）；放射免疫沉淀法裂解緩沖液（上海澤葉生物公司，貨號：ZY131006）；化學發光檢測試劑盒（上海Absin公司，貨號：abs920）；iScript cDNA合成試劑盒（中國Bio-Rad公司，貨號1708890）；SYBR Green 實時熒光定量 PCR 預混液試劑盒（北京Solarbio公司，貨號：QPK-201）；胎牛血清（美國Hyclone公司，貨號：SH30396.03），含雙抗的PBS液（美國Hyclone公司，貨號：SH30256．01）；定量反轉錄PCR試劑盒（北京Takara公司，貨號：RR430B）。

1.3 方法

1.3.1 定量反轉錄PCR 采用定量反轉錄PCR檢測腎結石腎乳頭組織內LINC01197、miR-516b-5p、SIRT3、Ac-FoxO1/FoxO1表達水平。應用TRIzol試劑分離組織或細胞中的總RNA；使用iScript cDNA合成試劑盒進行反轉錄反應合成cDNA；應用SYBR Green實時熒光定量PCR預混液試劑進行cDNA擴增。所有實驗均按照試劑或試劑盒說明書進行，引物序列見表1。

表1 反轉錄-聚合酶鏈反應引物序列

1.3.2 蛋白質免疫印跡法 采用蛋白質免疫印跡法檢測腎結石腎乳頭組織內SIRT3、Ac-FoxO1/FoxO1蛋白表達水平。應用放射免疫沉淀法裂解緩沖液收集組織或細胞內的總蛋白，20μg等量蛋白質上樣，經10%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，將總蛋白轉移至聚偏二氟乙烯膜上；再經5%脫脂奶粉室溫孵育聚偏二氟乙烯膜2h，4℃過夜孵育一抗抗體，室溫孵育二抗抗體2h。應用化學發光底物試劑盒顯示蛋白條帶并進行定量分析。

1.4 統計學方法

2 結果

2.1 腎結石成分分析

腎結石標本留取后進行紅外光譜分析，顯示結石的主要成分為草酸鈣，見圖1。

圖1 結石成分紅外光譜圖

2.2 兩組腎乳頭組織LINC01197、miR-516b-5p、SIRT3、Ac-FoxO1/FoxO1表達水平比較

與對照組相比，結石組的LINC01197和SIRT3表達減低，miR-516b-5p和Ac-FoxO1/FoxO1表達升高，差異均有統計學意義（<0.05），見圖2～5。蛋白質免疫印跡法檢測顯示，兩組腎乳頭組織中SIRT3表達減弱，Ac-FoxO1和FoxO1表達增高，見圖6。

2.3 LINC01197、miR-516b-5p、SIRT3的相關性分析

LINC01197與miR-516b-5p呈負相關（= –0.751，<0.01），LINC01197與SIRT3呈正相關（=0.813，<0.01），miR-516b-5p與SIRT3呈負相關（= –0.528，<0.05），見圖7～9。

圖2 兩組腎乳頭組織LINC01197表達水平比較

注：<0.05

圖3 兩組腎乳頭組織miR-516b-5p表達水平比較

注：<0.05

圖4 兩組腎乳頭組織SIRT3表達水平比較

注：<0.05

圖5 兩組腎乳頭組織Ac-FoxO1/FoxO1表達水平比較

注：<0.05

圖6 SIRT3、FoxO1和Ac-FoxO1蛋白表達

圖7 LINC01197與miR-516b-5p相關性

圖8 LINC01197與SIRT3相關性

圖9 SIRT3與miR-516b-5p相關性

3 討論

腎結石與晚期腎衰竭發生的風險密切相關，對人類的生命和公共健康已構成了巨大的威脅，研究顯示腎結石可能是一種與代謝綜合征密切相關的系統性疾病[4]。腎結石的化學成分取決于各種化學物質在尿液中的異常情況，根據結石的形狀、大小和化學成分的不同，腎結石可分為5種類型，其中含鈣結石是腎結石的主要類型，約占所有尿路結石的80%，由草酸鈣組成的鈣結石占比高達50%，是鈣結石的主要成分[5]，但腎結石形成的確切分子機制尚不清楚。

lncRNA是一類長度大于200個核苷酸的非編碼RNA，在轉錄、轉錄后及翻譯水平上參與調節基因的表達，已被證實在腫瘤發展中有關鍵作用[6-7]。有研究顯示，與健康對照組相比，腎結石患者、腎結石動物模型或細胞模型中存在大量lncRNA異常表達。Liang等[2]研究結果顯示，與健康個體相比，在草酸鈣結石患者的尿液中存在上千個異常表達的lncRNA，對其中6個lncRNAs 進行進一步研究發現，這些lncRNAs參與尿路結石的形成。LINC01197作為非編碼RNA，由1445個堿基組成，已被證明可以有效地調控腫瘤細胞的增殖、侵襲與遷移，同時可以有效地抑制類風濕關節炎患者病灶局部炎癥進展[8-9]，但其在腎結石的形成機制方面尚不清楚。

本研究結果顯示，在結石組患者的腎乳頭中觀察到LINC01197、SIRT3 低表達，miR-516b-5p、Ac-FoxO1/FoxO1高表達。miR-516b-5p與LINC01197存在結合位點[10]，本研究結果顯示miR-516b-5p與LINC01197表達呈顯著負相關，miR-516b-5p與SIRT3表達呈顯著負相關。SIRT3是一類保守的蛋白家族，具有DNA+依賴性蛋白脫乙酰基酶活性，可介導生物體對多種脅迫的適應性反應；同時，SIRT3作為線粒體基質中的主要脫乙酰基酶，在減少活性氧產生及緩解線粒體功能障礙中也起著至關重要的作用[10-11]。有研究表明，SIRT3在腎結石病理條件下表達下調，而在體外實驗中上調SIRT3能夠有效的抑制腎結石進展[12-13]。SIRT3可通過誘導FoxO1去乙酰化和促進巨噬細胞M2極化，抑制腎臟草酸鈣晶體的形成。本研究結果顯示，結石組的Ac-FoxO1/FoxO1表達增高，跟SIRT3表達升高呈一致性，充分證實了以上結論。

綜上所述，LINC01197在腎結石病理進展中的作用具有重要的潛在價值，其參與調節腎結石的發生發展可能跟miR-516b-5p、SIRT3、FoxO1關系密切。未來需進行更多的研究來進一步明確其作用機制。

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Expression of LINC01197 and related factors in renal papillary tissues from patients with kidney stones

Department of Urology, Taizhou First People’s Hospital, Taizhou 318020, Zhejiang, China

To investigate the expression and correlation of LINC01197, miR-516b-5p, SIRT3, FoxO1 and Ac-FoxO1 in renal papillary tissues of patients with kidney stones.A total of 30 patients with calcium oxalate kidney stones treated by percutaneous nephrolithotripsy admitted to the Taizhou First People’s Hospital from March 2021 to March 2023 were selected as the stone group, and a total of 30 patients with renal tumors who underwent radical nephrectomy (all of whom were diagnosed as clear-cell carcinoma by pathology after the operation) during the same period were selected as the control group. In the stone group, the renal papilla and its surrounding mesenchymal tissues were biopsied under intraoperative direct vision, while in the control group, samples of normal renal papilla tissues far away from the tumor (more than 2cm) were collected, and the diagnosis of normal renal papilla tissues was confirmed after pathological diagnosis. The expression levels of LINC01197, miR-516b-5p, SIRT3, FoxO1, and Ac-FoxO1 were detected and compared in the renal papilla tissues of the two groups, and the correlation between LINC01197, miR-516b-5p, and SIRT3 was analyzed.Compared with the control group, the renal papilla tissues of the stone group showed low expression of LINC01197 and SIRT3, and high expression of miR-516b-5p and Ac-FoxO1/FoxO1, all of which were statistically significant (<0.05). Spearman’s correlation analysis showed a significant negative correlation between LINC01197 and miR-516b-5p (=–0.751,<0.05), LINC01197 was significantly positively correlated with SIRT3 (=0.813,<0.05), and miR-516b-5p was significantly negatively correlated with SIRT3 (=–0.528,<0.05).LINC01197 has potential value in the pathological progression of kidney stones, and its participation in regulating the development of kidney stones may be related to miR-516b-5p, SIRT3 and FoxO1.

Long non-coding RNA; LINC01197; MiR-516b-5p; FoxO1; Kidney stone

R692.4

A

10.3969/j.issn.1673-9701.2023.23.008

（2023–03–11）

（2023–03–22）

臺州市社會科技發展計劃項目（21ywa46）

林謙，電子信箱：linqian_2004@163.com