基于藥效的氟康唑氯化鈉注射液處方工藝篩選

侯海婷，路曉兵，趙方紅，左亞茹，崔雪妹，楊嫻,2

1.石家莊四藥有限公司研發中心，河北省大容量注射劑工程技術研究中心，河北 石家莊 050000；2.石家莊四藥有限公司博士后科研工作站，河北 石家莊 050000

系統性真菌感染（system fungal infection，SFI）為一類由真菌引起的、侵犯深部臟器和/或血液的嚴重感染［1］。近年來，在器官移植患者、癌癥患者、艾滋病患者中，系統性真菌感染為其主要死亡原因，并且死亡率逐年升高［2］。白色念珠菌是臨床最常見的系統性真菌感染致病菌，對于免疫力低下的病人，白色念珠菌能夠入侵深層組織或進入血液循環系統，引發深部或者系統性真菌感染，威脅生命，死亡率高達46%～75%［3-6］。

氟康唑作為一種廣譜的三唑類抗真菌藥物，因其毒副作用小、對深部真菌感染療效顯著及藥代動力學特征優良等特點，成為WHO 指定的治療全身性真菌感染的首選藥物［7］。目前，國內氟康唑氯化鈉注射液的需求量穩步攀升，但國內僅有少數幾家企業的產品通過或者視同通過注射劑一致性評價。石家莊四藥有限公司研發中心（以下簡稱：本研發中心）對氟康唑氯化鈉注射液處方和生產工藝進行了優化篩選，藥學研究數據表明與氟康唑氯化鈉注射液上市參比制劑質量相當。為進一步驗證氟康唑氯化鈉注射液的體內抗真菌活性，并比較不同處方工藝對其體內抗真菌活性的影響，根據其臨床適應證，設計了氟康唑氯化鈉注射液抗系統性真菌感染的藥效學實驗，為其進一步處方工藝路線的確定和工藝參數的選擇提供參考。

1 材料

1.1 藥品

Y1：工藝A 氟康唑氯化鈉注射液，由石家莊四藥研發中心提供（規格：100 mL:氟康唑0.2 g 與氯化鈉0.9 g，批號：1609201805）。

Y2：工藝B 氟康唑氯化鈉注射液，由石家莊四藥研發中心提供（規格：100 mL:氟康唑0.2 g 與氯化鈉0.9 g，批號：1609201805a）。

Dif：氟康唑氯化鈉注射液，法國輝瑞公司PFIZER PGM（進口藥品注冊證號H20181194，規格：100 mL: 氟康唑0.2 g 與氯化鈉0.9 g，批號：B197105）。

1.2 動物

ICR 小鼠，160 只，雌性，6～8 周，18～22 g，上海西普爾-必凱實驗動物有限公司，清潔級，實驗動物許可證號：SCXK（滬）20130016。所有動物處于12 h 控制晝夜的房間，給予自由飲水和飲食。實驗符合實驗動物倫理委員會的倫理學標準。

1.3 菌株

白色念珠菌（Candida albicans，SC5314），由第二軍醫大學藥學院新藥研究中心真菌菌種庫提供。

2 方法

2.1 藥物配制

Dif、Y1、Y2 用生理鹽水分別配制成0.02 mg/mL、0.05 mg/mL、0.125 mg/mL 的溶液。上述所有供試藥物現配現用。

2.2 菌液配制

白色念珠菌SC5314 培養于30 ℃的YEPD 培養液中，200 rpm 振蕩培養，活化24 h。取處于指數生長期的細胞，培養于30℃的YEPD 培養液中，200 rpm 振蕩培養，活化16 h。取活化兩代菌液3 000 r/min 離心5 min，用0.9%生理鹽水洗滌3 次至上清液無色，棄去上清液，以0.9%生理鹽水將菌液濃度調為實驗所需濃度。

2.3 系統性真菌感染小鼠生存實驗

100 只小鼠，按體重隨機分為10 組（n=10），模型組（NS），Dif 高、中、低劑量組，Y1 高、中、低劑量組，Y2 高、中、低劑量組。所有小鼠尾靜脈注射5×106cell/mL 新配制的菌液0.1 mL/10 g體質量，約為0.2 mL。在小鼠系統性真菌感染模型建立2 h 后，每組低、中、高分別按0.2 mg/kg、0.5 mg/kg、1.25 mg/kg 尾靜脈注射Dif、Y1、Y2，模型組注射等體積的生理鹽水，連續給藥7 d。記錄造模后30 d 內系統性真菌感染ICR 小鼠的生存時間，并計算生存率，繪制生存曲線。

2.4 系統性真菌感染小鼠腎臟載菌實驗

60 只小鼠，按體重隨機分為10 組（n=6），模型組，Dif 高、中、低劑量組，Y1 高、中、低劑量組，Y2 高、中、低劑量組。造模及給藥方法如2.3。末次給藥后24 h，脫頸處死，取下左右雙側腎臟，稱量其總重量。將左右腎臟置1 mL PBS 中研磨勻漿，并依次稀釋至勻漿液的1/10、1/100、1/1 000 三個濃度，分別取100 μL 稀釋液涂于SDA 板，30 ℃培養48 h，通過計數SDA 板上的菌落數，計算腎臟載菌量。

2.5 統計學方法

Kaplan-Meier 法分析小鼠的生存情況，Log-rank 法評估生存曲線。ANOVA 和post hoc 法分析載菌量。

3 結果

3.1 Y1 與Y2 對系統性真菌感染小鼠存活時間的影響

實驗結果顯示，與模型組比，Dif 0.2 mg/kg、0.5 mg/kg、1.25 mg/kg 劑量組的系統性真菌感染ICR 小鼠生存曲線均顯著延長，均差異有統計學意義（P＜0.001）。與模型組比，Y1、Y2 的0.2 mg/kg、0.5 mg/kg、1.25 mg/kg 劑量組的系統性真菌感染ICR 小鼠生存曲線均顯著延長，均差異有統計學意義（P＜0.001）；Y1、Y2 的0.2 mg/kg、0.5 mg/kg、1.25 mg/kg劑量組分別與Dif 的等濃度劑量組相比，均差異無統計學意義（P＞0.05）。Y1 與Y2 的相同劑量組比，其生存曲線的差異無統計學意義（P＞0.05）。結果見圖1，表1。

表1 Y1、Y2治療真菌感染小鼠的平均存活時間

圖1 Y1、Y2治療真菌感染小鼠的生存曲線：A.Y1注射液治療真菌感染小鼠的生存曲線；B.Y2注射液治療真菌感染小鼠的生存曲線

3.2 Y1 與Y2 對系統性真菌感染小鼠腎臟載菌量的影響

實驗結果顯示，與模型組比，Dif 0.2 mg/kg、0.5 mg/kg、1.25 mg/kg 劑量組的小鼠腎臟載菌量顯著下降，差異有統計學意義；Y1 的0.2 mg/kg、0.5 mg/kg、1.25 mg/kg 劑量組小鼠的腎臟載菌量顯著下降，差異有統計學意義；Y2 的0.2 mg/kg、0.5 mg/kg、1.25 mg/kg 劑量組的小鼠腎臟載菌量也顯著下降，差異有統計學意義；小鼠腎臟的載菌量隨Dif、Y1、Y2 劑量的增加而降低。Y1、Y2 各劑量組與Dif 注射液相同劑量組比，小鼠腎臟的載菌量差異無統計學意義（P＞0.05）；Y1、Y2 相同劑量組比，小鼠腎臟的載菌量差異無統計學意義（P＞0.05）。結果見表2。

表2 Y1、Y2對小鼠腎臟載菌量的影響（）

表2 Y1、Y2對小鼠腎臟載菌量的影響（）

注：與NS（模型組）比較，aP＜0.05，bP＜0.001，cP＜0.01。

4 討論

氟康唑氯化鈉注射液上市多年，多用于包括念珠菌病、隱球菌病、球孢子菌病、芽生菌病和組織胞質菌病等多種真菌感染性疾病的治療，療效確切［8-9］。與其他抗真菌藥相比，氟康唑性質穩定，安全性較高，不良反應發生率低，是目前臨床應用較多的抗真菌藥之一［10］。

本研發中心對氟康唑氯化鈉注射液進行了研發，藥學研究數據表明與上市氟康唑氯化鈉注射液質量相當。本實驗利用小鼠建立系統性真菌感染動物模型，結合體內抗菌的藥效學評價方法，觀察氟康唑氯化鈉注射液不同制備工藝在抑制白色念珠菌方面的體內藥效，并與已上市氟康唑氯化鈉注射液進行對比。

尾部靜脈注射白念珠菌建立白色念珠菌感染模型的用量是在參考文獻和預實驗的基礎上確定的［11-13］。系統性白色念珠菌感染是導致免疫力低下患者死亡的重要原因［14］。上市氟康唑氯化鈉注射液、Y1、Y2 在ICR 小鼠體內具有抗白色念珠菌活性，且劑量依賴性地有效延長系統性真菌感染ICR 小鼠的存活時間，并提高ICR 小鼠的生存率（P＜0.001）；Y1、Y2 的0.2 mg/kg、0.5 mg/kg、1.25 mg/kg 劑量組分別與上市氟康唑氯化鈉注射液的相同劑量組比，生存曲線差異無統計學意義（P＞0.05）；Y1、Y2 相同劑量組比，其生存曲線差異無統計學意義（P＞0.05）。

所建立的小鼠系統性白色念珠菌感染模型與人體感染比較相似，感染的最主要靶器官都是腎臟［15］。上市氟康唑氯化鈉注射液、Y1、Y2 均能有效減少系統性真菌感染ICR 小鼠腎臟載菌量（P＜0.05）；Y1、Y2 的0.2 mg/kg、0.5 mg/kg、1.25 mg/kg 劑量組分別與上市氟康唑氯化鈉注射液的相同劑量組比，腎臟載菌量差異無統計學意義（P＞0.05）；Y1、Y2相同劑量組比，其腎臟載菌量差異無統計學意義（P＞0.05）。

綜上所述，受試藥物氟康唑氯化鈉注射液Y1、Y2 在小鼠體內具有抗真菌活性，其抗真菌活性與參比制劑上市氟康唑氯化鈉注射液的作用相當，且Y1、Y2 的抗真菌活性均隨藥物濃度的增加而增強；Y1、Y2 的體內抗真菌活性差異無統計學意義，表明氟康唑氯化鈉注射液不同的處方工藝對其體內抗真菌活性基本無影響。