標本配穴針灸對腹瀉型腸易激綜合征大鼠血清心臟ANP BNP的影響*

邱宇馳 付伊萌

腸易激綜合征(Irritable bowel syndrome,IBS)是功能性胃腸道疾病,《2020年中國腸易激綜合征專家共識意見》[1](簡稱共識)強調了精神心理因素是防治腸易激綜合征的一個關鍵。重視精神心理是提高治療IBS療效的關鍵。中醫的五臟學說認為“心主神”,心神失調,會出現焦慮和抑郁等精神障礙。同時心神失調與IBS內臟高敏感性密切聯系。《素問·至真要大論》曰:“諸痛癢瘡,皆屬于心”。心主神明便具有感知和應對身體內外刺激的能力,心神對疼痛刺激因素的反應是形成疼痛的重要條件[2],故IBS的核心病理生理基礎之一內臟高敏感性,在焦慮、抑郁等影響下會更加明顯,這與心神失調引起機體對疼痛程度的感受異常密切相關。

目前,針對IBS伴隨的焦慮、抑郁等情緒障礙西醫治療選用抗抑郁藥物[3],有一定的不良作用。中醫針灸作為綠色療法,是西醫治療IBS的重要的替代療法[4]。心房利鈉肽(Atrial natriuretic peptide,ANP)主要由心房合成分泌,在疾病狀態下心房容量/壓力增加,刺激ANP釋放,具有調節應激反應和焦慮等情緒狀態的作用[5]。研究報道,心理調適能夠通過改善患者的焦慮抑郁情緒,減少兒茶酚胺的含量、減輕腎素-血管緊張素-醛固酮的作用,進而降低患者的B型利鈉尿肽(B-type natriuretic peptide,BNP)水平[6]。因此,筆者選用“調心神,固腸腑”的標本配穴針灸,探究標本配穴針灸是否能夠通過調控ANP、BNP表達,從而改善IBS-D模型大鼠的焦慮、抑郁情緒。

1 材料

1.1 動物與分組SPF級3月齡雄性SD大鼠40只,體質量(300±20)g,隨機分為4組:對照組、模型組、標本配穴組、常規配穴組,每組10只。購于三峽大學實驗動物中心,許可證號:SCXK(鄂)2017-0012。在武漢體育學院飼養,SPF級環境條件控制為溫度(22±2)℃、濕度(50±10)%,光照明/暗周期為12 h/12 h[7],適應性喂養1周,期間自由飲食、飲水。動物實驗倫理審核批準號:NO.00287500。嚴格遵照中華人民共和國科學技術部2006年發布的《關于善待實驗動物的指導性意見》[8]進行實驗操作。

1.2 主要儀器與試劑BL-420S生物機能實驗系統(成都泰盟科技有限公司);微量移液器(Eppendorf);垂直電泳槽(北京六一儀器廠,DYCZ-24DN);電子天平(北京賽多利斯儀器系統有限公司,CPA);水平搖床(江蘇海門其林貝爾儀器制造有限公司,TS-1);磁力攪拌器(江蘇省金壇市中大儀器廠,T8-1);酶標儀(Thermo,mμlISKANMK3);離心機(湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司,HI650)。生理鹽水(ASPEN,AS1087)戊巴比妥鈉(Sigma,DS179);一次性針灸針(0.30 mm×13 mm,華佗牌);水銀臺式血壓計(上海魚躍醫療設備有限公司);Rat ANP ELISA Kit(ELK5450,ELK Biotechnology);Rat BNP ELISA Kit(ELK5457,ELK Biotechnology)。

1.3 模型制備除對照組大鼠外,其他3組以急、慢性應激相結合CAS方法制備IBS-D模型[9]。采取將大鼠暴露于7種不同的壓力源,分別是缺水24 h、食物剝奪24 h、痛苦的夾尾巴1 min、暴露于45 ℃環境5 min、在4 ℃水中游泳3 min,白天和夜晚倒置12 h/12 h,水平振動(120 r/min)45 min。連續2 d保證無重復特定的壓力源,若抓鬮的壓力源重復則重新抓取,共21 d。1周的休息之后,第28天,采取急性束縛應激方法,包裹大鼠的肩部、上肢前肢和胸廓1 h。當天測定內臟疼痛閾值[10],若模型組大鼠內臟疼痛閾值高于對照組(P<0.05),則提示造模成功[11]。

1.4 干預方法標本配穴組、常規配穴組大鼠在每日造模前,穿上自制合身的鼠衣,參照《實驗動物常用穴位名稱與定位第2部分:大鼠》[12]。標本配穴組選取“內關、足三里、關元”予以針灸干預,常規配穴組選取“上巨虛、天樞、足三里”予以針灸干預,均使用0.30 mm×13 mm華佗牌毫針直刺,針刺得氣后進行手法行針,平補平瀉,頻率120次/min,每隔4 min行針1 min;懸掛并進行艾灸,自制艾條長12 cm,直徑7 mm,用支架固定,置于穴位旁 2～3 cm,保證大鼠在平靜的狀態下,留針及艾灸時間為15 min,1次/d,共28 d。對照組和模型組不給予任何干預。

1.5 檢測指標

1.5.1 內臟高敏感性測定測定內臟高敏感性,即觀察腹壁撤退反射(Abdominal withdrawal reflex, AWR)。在造模前和第28天進行檢測,檢測前1 d大鼠禁食不禁水,操作時一人固定大鼠及暴露肛門,另一人一手手持蘸有液體石蠟的棉簽,另一手順著棉簽的引入,將蘸有液體石蠟的自制氣囊導管從肛門插入直至到標記位置(長度為4.5 cm處標記),再用醫用膠帶將導管固定于尾巴根部,然后將大鼠放置操作臺上。待大鼠安靜后,一人用自制血壓計向氣囊內緩慢平穩加壓,另一人記錄大鼠腹部抬離地面時或背部拱起所對應的壓力值,每次測量間隔約5 min,每只重復測量3次取平均值[13]。

1.5.2 大鼠的行為學觀察糖水偏好實驗觀察:每籠給予200 ml 1%蔗糖水溶液和純化水各1瓶,12 h后對換1次2個瓶子位置,24 h后測量瓶內液體的消耗,糖水偏好率(%)=糖水攝入(ml)/(糖水攝入+純水攝入)(ml)×100%[14]。曠場實驗觀察:第28天通過曠場實驗進行行為學評估。實驗員單獨在觀察室操作,環境要保證避光、安靜,采用專業的曠場箱,底為100 cm×100 cm,其底面為黑色并平均分為16格,攝像頭位于正中央,將大鼠放置曠場箱底部,觀察5 min內大鼠的活動情況,并在每次結束后用酒精進行消毒、清洗曠場箱內部,以便影響下1只大鼠的自由活動,采用計算機軟件進行錄像記錄。

1.5.3 血清 心臟組織內分泌肽檢測2%戊巴比妥鈉(0.2 ml/100 g)[15]腹腔注射麻醉,剖開胸腔,大鼠腹主動脈采血離心分離血清,-80 ℃低溫冰箱儲存備用,取出心臟組織,用生理鹽水洗凈,并放入-80 ℃冰箱保存備用。酶聯免疫吸附法(ELISA)定量檢測心房利鈉肽(Atrial natriuretic peptide,ANP)、B型利鈉尿肽(B-type natriuretic peptide,BNP)含量,按試劑盒步驟說明操作。

2 結果

2.1 大鼠內臟疼痛閾值比較在造模前,4組大鼠進行內臟疼痛閾值測定比較,差異無統計學意義(P>0.05)。造模后,模型組大鼠內臟疼痛閾值低于對照組(P<0.01),提示造模成功。標本配穴組、常規配穴組大鼠內臟疼痛閾值高于模型組(P<0.01)。見圖1。

注:與對照組比較,****P<0.01;與模型組比較,※※※※P<0.01。圖1 大鼠內臟疼痛閾值比較

2.2 大鼠糖水偏好率比較模型組大鼠的糖水偏好率明顯高于對照組(P<0.01),標本配穴組、常規配穴組大鼠的糖水偏好率低于模型組(P<0.01)。常規配穴組與標本配穴組大鼠比較糖水偏好率,差異無統計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 大鼠糖水偏好率比較

2.3 大鼠曠場實驗比較對照組大鼠的運動軌跡自由且總路程長,模型組大鼠的運動軌跡多在外圍且總路程短;標本配穴組大鼠、常規配穴組大鼠較模型組運動軌跡范圍更廣且總路程增加。見圖2。

注:圖2A為對照組大鼠的5 min內的行動軌跡路徑;圖2B為模型組大鼠的5 min內的行動軌跡路徑;圖2C為標本配穴組大鼠的5 min內的行動軌跡路徑;圖2D為常規配穴組大鼠的5 min內的行動軌跡路徑。圖2 各組大鼠行動軌跡圖

2.4 大鼠血清 心臟組織ANP BNP含量比較模型組大鼠血清中ANP、BNP含量高于對照組(P<0.01);標本配穴組大鼠血清中ANP、BNP含量低于模型組(P<0.01);常規配穴組大鼠與模型組大鼠比較血清中ANP、BNP含量,差異有顯著統計學意義(P<0.01);但標本配穴組大鼠與常規配穴組大鼠比較血清中ANP、BNP含量,差異無統計學意義(P>0.05)。見圖3A。模型組大鼠心臟組織中ANP、BNP含量高于對照組(P<0.05);常規配穴組大鼠心臟組織中ANP、BNP含量高于標本配穴組(P<0.05)。見圖3B。

注:圖3A、B為大鼠血清、心臟ANP、BNP含量變化。與對照組比較,****P<0.01,*P<0.05;與模型組比較,※※※※P<0.01;與標本配穴組比較,####P<0.01,#P<0.05。圖3 大鼠血清 心臟ANP BNP含量變化

3 討論

IBS屬于中醫學“腸郁”范疇,病因是心神失調,腸腑失司。在中醫治病求本思想和標本理論的指導下,根據“病位在腸腑,臟腑為本,通調腸腑;病邪為標,祛除邪氣,調養心神”理論,提出以標本配穴針灸防治IBS,以固護腸腑為主,調理心神為輔,標本兼治。標本配穴針灸對IBS的治療,是重視心神不寧對腸腑功能的影響。認為該病是因心神不安,氣機失調,導致腸腑失司。取內關,可充分發揮其寧心安神、調神定志之功效,改善焦慮、抑郁的狀態,減輕心神失調對腸道的影響。陳慧君[16]探析焦慮癥的針灸臨床治療及選穴特點,發現對焦慮癥的治療一般是“從腦論治”和“從心論治”。而百會、內關及神門穴治療焦慮癥具有特殊療效,是關鍵穴位。內關穴在治療焦慮癥中多用補法加灸[16]。研究發現,氟哌噻噸美利曲辛聯合針刺內關穴能顯著緩解老年冠心病患者PCI術后焦慮抑郁狀態[17]。對針灸治療卒中后焦慮癥的取穴規律進行數據挖掘,發現經脈的選擇以督脈、手少陰心包經、手厥陰心經為多,而選穴多以百會、內關、神門、印堂[18]。

本研究選用CAS造模方法建立伴有精神障礙的IBS模型大鼠,并依據中醫針灸治病求本思想,應用標本配穴法,選取“關元、足三里、內關”三穴進行腧穴配伍治療,探究IBS與心相關的情緒心理的變化。模型組大鼠的內臟高敏感性高于對照組,為造模成功。標本配穴組和常規配穴組大鼠內臟高敏感性均低于模型組,說明標本配穴針灸和常規配穴針灸均能減輕大鼠的腹痛,減輕焦慮、抑郁的程度。抑郁樣行為一般通過糖水偏好實驗觀察,糖水偏好率直接反映大腦的獎賞反應程度,而獎賞反應程度與快感缺失密切相關。焦慮樣行為通常是通過曠場實驗觀察,反應其自由活動度。本實驗中糖水偏好實驗和曠場實驗觀察結果顯示,IBS模型大鼠快感度缺失、自主活動度降低,情緒心理行為異常改變,處于焦慮、抑郁的狀態。標本配穴組和常規配穴組糖水偏好率均高于模型組大鼠,說明標本配穴針灸和常規配穴針灸均能一定程度地改善大鼠快感度缺失程度,但標本配穴組的數值更趨向于對照組,效果更佳。曠場實驗結果顯示,標本配穴組和常規配穴組大鼠的行為學均有一定的改善,但標本配穴針灸更能改善焦慮狀態,增加其活動自由度。

研究發現,ANP與焦慮障礙的發病密切相關,是聯系心臟和焦慮行為的重要物質基礎[19]。本實驗模型組大鼠血清、心臟組織ANP含量均增加,一方面說明IBS-D大鼠處于焦慮狀態,另一方面說明IBS-D大鼠在壓力刺激下心臟相關物質產生了變化。也有研究提出,BNP與兒茶酚胺水平中度相關[20]。本實驗模型組大鼠血清、心臟組織中BNP含量均升高,可能是模型大鼠處于焦慮狀態,刺激了兒茶酚胺的釋放,加強了腎素-血管緊張素-醛固酮的作用,升高了BNP水平。標本配穴組大鼠血清中ANP、BNP含量均低于模型組,常規配穴組大鼠血清中僅BNP含量下降;而在心臟組織中,標本配穴組大鼠ANP、BNP含量均下降,常規配穴組大鼠ANP、BNP含量均上升,說明標本配穴針灸更能夠下調血清和心臟組織ANP含量,改善其焦慮情緒,并能減輕應激反應程度,減少血清和心臟組織BNP的分泌,而達到保護心臟的作用。

綜上,標本配穴針灸能夠通過降低血清、心臟ANP、BNP的表達,改善焦慮抑郁情緒,推測標本配穴針灸可能通過抑制ANP、BNP活性,從而調節IBS-D模型大鼠的焦慮、抑郁情緒。