不同離心參數(shù)對小劑量全血白膜法采血袋制備富血小板血漿回收率的影響*

張 彬,陸 華,宋娜麗,王世春,劉 奇,吳春曦,易中梅△

(1.陸軍軍醫(yī)大學第一附屬醫(yī)院輸血科/中國人民解放軍重慶血站,重慶 400038;2.重慶醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院輸血科 400010)

富血小板血漿(platelet-rich plasma,PRP)在治療難愈合性創(chuàng)面、關節(jié)損傷及皮膚年輕化等應用醫(yī)學的效果優(yōu)勢,讓PRP的制備技術也得到飛速發(fā)展[1-2]。目前PRP分為手工分離制備和血細胞分離機采集(機采),機采回收率穩(wěn)定,但需患者有足夠的血容量及良好的心肺功能,在采集過程中,能夠耐受短時間內≥400 mL血液短暫離體。體重較輕的患者血容量較少、年紀較大的患者心功能對失血的耐受性差,采集風險較大。對于低體重又需用自體PRP的患者,小劑量全血白膜法血袋制備技術顯得尤為重要。全血來源現(xiàn)有制備劑量200、300、400 mL,采血袋制備PRP均有相關制備技術的報道[3-5],為了彌補更小劑量全血采血袋制備PRP的研究空白,本課題組對50、100 mL全血不同制備參數(shù)下獲得PRP回收率進行了比較分析,旨在確定該條件下制備PRP的最佳方法,更好地滿足臨床需求,現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集相同來源的全血50、100 mL各75袋。儀器和試劑:一次性使用塑料四聯(lián)采血袋(批號210818,四川南格爾公司),50、100 mL轉移袋(批號210401、210402,四川南格爾公司),大容量低溫離心機(型號6000i,德國Thermo公司),Hemax330血球計數(shù)儀(山東煙臺),CM735A采血秤(韓國森通公司),SE250熱合機(韓國森通公司),分光光度計(型號UNIC7200,上海尤尼柯公司)。本研究經(jīng)陸軍軍醫(yī)大學第一附屬醫(yī)院倫理委員會審批通過[倫理批件號:(A)KY2021057]。

1.2 方法

1.2.1分組

將相同來源的全血50、100 mL各75袋根據(jù)離心時間(9、11、13、15、17 min)分為5組,每組15例,手工分離白膜,比較白膜層血小板回收率。將白膜10 mL×60袋、20 mL×70袋根據(jù)離心時間(9、13、17 min)分為3組,分離PRP,在20 mL白膜70 g離心力時增加1組21 min離心時間,分組增加為4組,每組均為10例,比較PRP血小板回收率;同時檢測并比較在該條件下PRP血小板低滲休克反應(hypotonic shock response,HSR)比率,每組各6例。

1.2.2確定離心力

第1次離心:根據(jù)團隊前期制備濃縮血小板的經(jīng)驗參數(shù)(1 875 g,22 ℃,15 min)[6],離心時間及溫度不變,均使用100 mL轉移袋,倍比下降整數(shù)設置離心力梯度,依次為940、470、240 g。肉眼觀察白膜層的緊實度適宜:全血取出時,白膜層無渾濁,分離時白膜層上浮無附壁。50、100 mL全血分別確定離心力為470、940 g。第2次離心:參照參數(shù)(70～100 g,22 ℃,10 min)[7-8],離心時間及溫度不變,均使用50 mL轉移袋,設置離心力梯度為100、70 g,肉眼觀察紅細胞下沉的緊實度適宜,10、20 mL白膜分別確定離心力為70、100 g。

1.2.3制備PRP

將50、100 mL全血進行第1次離心,分別按照470、940 g,(22±2)℃,9、11、13、15、17 min離心,分離白膜層為10、20 mL,分離后靜置1 h,震搖30 min,測量白膜層血小板計數(shù),計算白膜層血小板回收率。將白膜10、20 mL分別以70、100 g,(22±2)℃,9、13、17、21 min(僅在70 g比較)進行第2次輕離心,分離PRP,靜置1 h,震搖30 min,檢測血小板計數(shù),計算PRP血小板回收率。

1.2.4測定HSR比率

PRP用自身貧血小板血漿(platelet poor plasma,PPP)稀釋至血小板 200×109/L～400×109/L,與PPP、蒸餾水均置于37 ℃保溫,磷酸鹽緩沖溶液(phosphate buffer saline,PBS)pH 7.4,PPP與PBS按2∶1的體積比混合調零,PRP與PBS 按2∶1的體積比混合作為對照管,PRP與蒸餾水按2∶1的體積比混合作為樣品管,在610 nm處讀取樣品最小吸光度(A)值及15 min時A值,并按下列公式計算HSR比率:

1.2.5觀察指標

全血白膜層血小板回收率、白膜層PRP血小板回收率、PRP HSR比率。

1.2.6標本留取

白膜混勻后留取0.5 mL,測定血小板計數(shù);PRP留取4～7 mL,進行血小板計數(shù),再檢測HSR比率。

1.3 統(tǒng)計學處理

2 結 果

2.1 不同離心時間白膜層血小板回收率比較

50 mL全血在470 g離心11～17 min白膜層血小板回收率處于較高水平,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05);100 mL全血在940 g離心11～15 min白膜層血小板回收率處于較高水平,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。兩種劑量白膜層血小板回收率可在離心11 min時即達到較高水平,見表1。

表1 不同離心時間白膜層血小板回收率比較

2.2 不同離心時間PRP血小板回收率比較

10 mL白膜在70 g、離心13 min PRP血小板回收率最高,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05);20 mL白膜在100 g、離心13 min PRP血小板回收率最高,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),見表2。

表2 不同離心時間PRP血小板回收率比較

2.3 不同離心時間PRP HSR比率比較

10 mL白膜在70 g、離心13 min及100 g、離心9 min PRP HSR比率最高,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05);20 mL白膜在70 g、離心17 min及100 g、離心13 min PRP HSR比率最高,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),見表3。

表3 不同離心時間PRP HSR比率比較

3 討 論

血小板制劑用于臨床非輸注性(局部)治療或輸注性(全身)治療,均是全血來源的血小板濃縮物,制備技術及臨床需求既有重疊又存在較大區(qū)別(為了方便論述,文中PRP僅指非輸注性血小板制劑),如兩者血袋白膜法制備的技術原理完全相同,但50、100 mL全血提取的血小板終產品由于劑量小(10～20 mL),輸注后不能達到治療效果,既無臨床需求,也未發(fā)現(xiàn)相關的制備參數(shù)報道,但作為PRP進行局部治療有廣闊的應用空間,相應的制備參數(shù)也需研究確定并完善發(fā)展。PRP含有大量的生長因子及纖維蛋白,對創(chuàng)面及損傷的修復有極大優(yōu)勢[7,9-10]。小劑量全血制備PRP適合低體重及創(chuàng)面小的患者,因容量小,手工分離制備技術更加精細;且相關研究較少,可借鑒的經(jīng)驗不足;較標準量全血(200、300、400 mL)制備PRP更加困難。文獻報道小劑量全血多采用離心管制備,制備過程開放環(huán)節(jié)有污染的風險[8];或是套裝制備,需要現(xiàn)場采集,立即制備,盡快使用,且不可儲存,在使用時間上受到制約。小劑量全血采血袋制備PRP技術全程封閉,無菌接駁分裝備用,既規(guī)避了開放環(huán)節(jié)風險的發(fā)生,又可儲存,可靈活地調整使用時間。

50、100 mL全血第1次離心后收集白膜為10、20 mL(定量),血小板回收率(變量)最高的數(shù)據(jù)反映的是最佳離心條件。本研究顯示,使用采血袋制備小劑量全血,50、100 mL全血470、940 g,(22±2)℃,離心11 min時,全血白膜層血小板回收率即達到較高水平。與文獻報道400 mL全血四聯(lián)采血袋制備的白膜層血小板回收率(87.0%)相比較[11],本研究白膜層血小板回收率略低,因本實驗使用的全血劑量小,如果血袋的整個制備流程血小板耗損量相同,由于全血劑量小而耗損占比更高,白膜層血小板回收率則會較低。該報道還闡述了改變制備血袋的結構,可減少血小板損失,明顯提高回收率,所以改變血袋結構可成為提升小劑量全血白膜層回收率的研究方向之一。本研究顯示,10、20 mL白膜在70、100 g,(22±2)℃,離心13 min PRP血小板回收率最高。與本課題組前期研究的400 mL全血6聯(lián)袋制備濃縮血小板回收率(68.7%)相比,離心溫度無改變,但本研究得到的PRP血小板回收率較高[12],說明50、100 mL全血第2次(即對白膜層的離心)離心力及離心時間均是更加適宜的離心參數(shù)。

HSR是通過在體外低滲休克環(huán)境中,血小板膨脹后再恢復正常體積的能力來反映血小板體內存活率,是評價血小板功能的體外指標,HSR比率越高,血小板活性恢復越好[13]。本研究顯示,100 mL全血制備的PRP第2次離心為70 g、離心17 min時,HSR比率為(59.53±6.60)%,繼續(xù)延長離心時間到21 min也不會導致HSR比率下降,即體內存活無明顯下降,與離心100 g相比,離心13 min HSR比率為(45.74±3.28)%,說明離心力越輕,HSR比率越高,血小板損傷越小。離心70 g、13 min時,HSR比率最低[(34.72±4.47)%)],離心力最輕,HSR比率卻最低。分析認為,雖然HSR受PRP溫度、存放時間等因素影響,但因各組的條件一致,不是差異產生的決定性條件[14-16]。此外,PRP中混雜的紅細胞較多,在HSR實驗中添加蒸餾水的環(huán)節(jié)造成細胞部分溶血,影響透光度導致離心時間更長時HSR比率更低,而非PRP中血小板功能受到影響[14]。同時表明,檢測HSR比率時,紅細胞應盡可能去除完全,否則影響實驗結果。在100 g、離心13 min時,HSR比率為(59.39±4.10)%,與70 g、離心17～21 min相當,隨著離心時間延長,HSR比率下降,說明離心時間越短,HSR比率越高,血小板損傷越小[17]。本著提升工作效率的原則,相同的HSR比率選取用時最短的參數(shù),綜合PRP回收率,100 mL全血制備PRP,第2次離心的優(yōu)選參數(shù)為100 g、(22±2)℃、13 min。同理50 mL全血制備PRP,第2次離心優(yōu)選參數(shù)為70 g、(22±2)℃、13 min。

綜上所述,50、100 mL全血白膜法采血袋制備PRP能夠獲得理想的回收率,在其他離心條件相同的情況下,第1次離心力分別為470、940 g,離心11 min,第2次離心力分別為70、100 g,離心13 min,回收率最佳。該方法是標準劑量全血(200、300、400 mL)制備PRP的補充方法。