臍帶間充質干細胞源外泌體通過自噬對腎小管上皮細胞凋亡的抑制作用研究*

雷 艷,詹世淮,楊 蘭,王佳偉,王水良,趙 猛,張勝行△

(中國人民解放軍聯勤保障部隊第九〇〇醫院:1.福建省干細胞臨床應用中心;2.福建省適配體技術重點實驗室;3.基礎醫學實驗室,福州 351100)

人臍帶間充質干細胞來源的外泌體(human umbilical cord mesenchymal stem cells derived exosomes,hUC-MSCs-Exo)可以轉運核酸、脂質和蛋白質,參與細胞間的信息交流,具有與MSCs相似的組織損傷修復和再生功能[1-2]。急性腎損傷(acute kidney injury,AKI)是一種以腎功能減退為特征的癥候群,缺氧、腎缺血再灌注損傷(renal ischemia reperfusion injury,IRI)、腎毒性和炎癥等均可導致AKI[3-4]。已有研究表明,MSCs-Exo種攜帶的miRNA和蛋白能減輕腎臟缺血再灌注損傷,減少細胞凋亡,促進細胞增殖,從而修復腎損傷[5];Exo中含有與血管生成(血管內皮生長因子、促血管新生蛋白因子)和轉化生長因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)信號相關的營養蛋白分子而促進腎臟再生[6-7]。MSCs-Exo可以通過調節ATL16L增強細胞自噬,預防順鉑藥物所致的AKI[8]。盡管MSCs-Exo顯示出腎臟保護作用,但MSCs-Exo對腎小管上皮細胞(human renal tubular epithelial cells,HKC)的作用機制仍不清楚。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1試劑

衣霉素(tunicamycin,TM)購于瑞士Enzo Life Sciences公司。DMEM DF12、DMEM低糖培養基均購于美國Hyclone公司。胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)、抗體PARP、LC3B、Atg5、Beclin1、β-actin、兔免疫球蛋白G(IgG)、鼠IgG均購于美國Cell Signaling Technology公司。流式抗體CD63、CD9、CD81,碘化丙啶(Propidium Iodide,PI)染料,FITC Annexin Ⅴ凋亡檢測試劑盒購于美國Biolenged公司;PierceTMBCA蛋白定量試劑盒購于美國Thermo公司。增強化學發光(enhanced chemiluminescence,ECL)蛋白顯色液購于德國Advansta公司。CCK-8細胞增殖檢測試劑盒購于印度MedChem公司。ExoQuick-TC試劑盒購于美國SBI公司。

1.1.2細胞

293T細胞和HKC購于中國科學院上海細胞生物學研究所;hUC-MSC由福建省干細胞應用工程技術研究中心提供,取P3代細胞。

1.2 方法

1.2.1細胞培養

HKC培養于10% FBS的高糖培養基中,細胞均置于含體積分數為5% CO2、飽和濕度的37 ℃培養箱中。hUC-MSCs培養于含10% FBS的低糖培養基中。

1.2.2CCK-8檢測細胞增殖活性

HKC胰酶消化后鏡下計數細胞,5 000個/孔接種于96孔板,次日含0.5% FBS DMEM高糖培養基將TM稀釋成不同濃度(0、1、2、4 μg/mL)100 μL每孔,24 h后每孔加入10 μL的CCK-8溶液,將培養板置于培養箱內溫育2 h,將96孔板置于酶標儀上,測定450 nm處吸光度值,以Con組為100%,則細胞存活率=(試驗組吸光度值/Con組吸光度值)×100%。

1.2.3Exo的鑒定

提取的40 μL Exo與5 μL硫酸鹽微珠室溫共孵育15 min,加入100 μmol/L的牛血清清蛋白(bovine serum albumin,BSA)溶液5 μL,室溫孵育15 min。加入1 mL磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffered saline,PBS)孵育75 min,580 r/min離心5 min,去上清液。將Exo微珠的結合體中加入1 mL 100 mmol/L的甘氨酸溶液室溫孵育30 min,經離心PBS洗滌2次后,重懸在350 μL PBS中,每管50 μL分裝于流式管中,加入CD9、CD63、CD81的一抗(1∶200)避光孵育45 min,離心重懸后立即通過流式細胞術檢測。

1.2.4實時熒光定量聚合酶鏈反應(real-time quantitative polymerase chain reaction,qRT-PCR)檢測mRNA的表達

收集TM處理的細胞,TRIzol法提取細胞總RNA,取各樣本1 μg逆轉錄為cDNA。以β-actin為內參,檢測LC3B、Atg5、Beclin1基因mRNA的表達,各基因的引物序列見表1。qPCR體系為:SYBR 5 μL,引物5 μmol/L 0.5 μL,cDNA 2 μL,ddH2O 3.5 μL,PCR擴增程序為:94 ℃預變性10 min,94 ℃變性15 s,58 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s,30次循環。mRNA的表達以2-ΔΔCT方式計算。

表1 qRT-PCR擴增引物序列

1.2.5蛋白質印跡法(Western blotting)檢測蛋白表達

收集不同處理組的蛋白樣品,經BCA法蛋白定量后,取30 μg蛋白樣品進行聚丙烯酰胺凝膠電泳,并轉移至聚偏二氟乙烯膜上。室溫下4% BSA搖床上封閉1 h后,與1∶1 000稀釋的一抗4 ℃孵育過夜。TBST洗膜5 min/3次,加入不同比例稀釋的辣根過氧化物酶(HRP)標記的二抗,室溫孵育1 h,經TBST、PBS各洗膜5 min/3次后,加入ECL發光液暗室曝光,最后使用Bio-Rad公司的Quantity One軟件測得各條帶的灰度值(3次結果的平均值)與內參β-actin進行校正和結果分析。

1.2.6流式細胞分選技術(fluorescence-activated cell sorting,FACS)檢測細胞凋亡

HKC經胰酶消化后收集細胞沉淀,預冷的PBS洗滌兩次,加入試劑盒中的結合液100 μL重懸,每管各加入5 μL FITC Annexin Ⅴ避光染色15 min后,再加入5 μL PI染色5 min,最后每管加入400 μL結合液重懸后即可上機檢測。

1.2.7細胞免疫熒光檢測

HKC經各組處理,4%多聚甲醛室溫固定30 min,PBS洗滌3次,加入抗體稀釋液封閉2 h,按1∶200比例加LC3B的一抗4 ℃孵育過夜,含0.1% Triton X-100的PBS洗滌3次后加入二抗,避光孵育1 h,PBS洗滌后,1 mg/mL DAPI染色5 min,熒光顯微鏡拍照觀察。

1.3 統計學處理

2 結 果

2.1 TM誘導HKC凋亡情況

1、2、4 μg/mL TM處理的細胞存活率分別為52.9%、46.2%、35.9%,且與Con組比較,差異均有統計學意義(P<0.05),TM能明顯抑制細胞增殖(圖1A)。凋亡蛋白PARP的表達呈濃度依賴性的上調(圖1B)。流式細胞術檢測細胞凋亡結果顯示,1、2、4 μg/mL TM處理的細胞凋亡率分別為(18.56±1.88)%、(22.80±1.37)%和(28.55±2.71)%,與Con組比較差異均有統計學意義(P<0.05),見圖1C。

A:不同濃度TM對細胞增殖活性的影響;B:Western blotting檢測細胞凋亡蛋白PARP;C:PI單染檢測細胞凋亡;*:P<0.05,與Con組比較。

2.2 TM誘導HKC自噬情況

1、2、4 μg/mL TM處理后均會促進自噬標志性蛋白LC3B表達,且自噬相關蛋白Atg5和Beclin1的表達也明顯上調(圖2A)。與Con組比較,1 μg/mL TM處理(TM組)自噬基因LC3B的表達上調6.08倍,Atg5的表達上調5.25倍,Beclin1的表達上調12.62倍(圖2B),TM誘導HKC自噬信號通路被激活。

A:TM誘導HKC發生自噬;B:自噬基因LC3B、Beclin1和Atg5表達水平;**:P<0.05,與Con組比較。

2.3 hUC-MSCs-Exo的分離與鑒定情況

流式細胞術檢測結果顯示,hUC-MSCs-Exo中CD9(81.0%)、CD63(86.6%)和CD81(82.4%)陽性標志物均陽性表達,陽性表達率為81.0%、86.6%、82.4%(圖3A)。hUC-MSCs-Exo經NTA粒徑分析,大小約為100 nm(圖3B)。

A:FACS鑒定Exo標志分子CD63、CD9、CD81結果;B:hUC-MSCs-Exo NTA粒徑分析。

2.4 hUC-MSCs-Exo促進HKC自噬情況

與TM組(1 μg/mL TM處理)比較,該過程中加入75、100、150、200 μg/mL Exo能促進細胞增殖活性,差異均有統計學意義(P<0.05),見圖4A。FACS檢測TM組LC3B細胞陽性的表達率為(14.83±2.87)%,TM+Exo組(150 μg/mL Exo處理)LC3B細胞陽性的表達率為(25.28±1.03)%,兩組比較差異有統計學意義(P<0.05),見圖4B、4C。細胞免疫熒光分析的結果顯示,與TM組比較,TM+Exo組LC3B的熒光陽性細胞明顯增多,差異有統計學意義(P<0.05),見圖4D。

A:CCK-8檢測Exo對細胞增殖活性的影響;B、C:FACS檢測LC3B的表達;D:熒光顯微鏡檢測細胞自噬分子LC3B的熒光強度(200×)。D中,a:Con組DAPI細胞核染色;b:Con組LC3B免疫熒光染色;c:a、b圖的疊加;d:TM組DAPI細胞核染色;e:TM組LC3B免疫熒光染色;f:d、e圖的疊加;g:TM+Exo組DAPI細胞核染色;h:TM+Exo組LC3B免疫熒光染色;i:g、h圖的疊加。*:P<0.05,與TM組比較。

2.5 hUC-MSCs-Exo抑制TM誘導的細胞凋亡

與TM組比較,TM+Exo組凋亡蛋白PARP的表達下調,見圖5A。流式細胞術分析結果顯示,TM組的細胞凋亡率為(11.37±1.70)%,高于TM+Exo組的(7.72±0.38)%,差異有統計學意義(P<0.05),見圖5B。

A:Western blotting檢測凋亡蛋白PARP;B:流式細胞術檢測細胞凋亡。

3 討 論

目前,研究人員已經提出了多種AKI的發病機制,包括腎單位數量減少、血流量減少和缺氧引起的內皮損傷、表觀遺傳學改變、腎臟毒性、腎小管細胞周期阻滯或炎癥等[9]。雖然AKI的發病機制不盡相同,但最終都以腎小管細胞損傷(凋亡、壞死)造成不可逆轉的腎功能損傷為主要病變特征,尤其是腎小管細胞凋亡在AKI的發生、發展中起重要作用[10]。本研究中,1、2、4 μg/mL TM處理HKC 24 h后均能抑制細胞增殖活性,并呈水平依賴性;流式細胞術檢測結果也表明TM能誘導HKC凋亡。

研究報道,MSCs-細胞外囊泡通過傳遞miRNAs分子誘導ERK1/2表達增強,促進近端HKC的存活[11]。hUC-MSCs-Exo通過傳遞營養因子14-3-3ζ,與自噬誘導所必需的蛋白質ATG-16L相互作用,促進HKC自噬,誘導細胞存活,從而介導抗順鉑誘導的AKI,導致細胞凋亡并減少炎癥反應,能促進腎功能恢復[12]。本研究表明,hUC-MSCs-Exo與TM共處理能明顯增強細胞增殖活性,誘導HKC自噬標志分子LC3B、Atg5、Beclin1的表達上調;細胞免疫熒光和流式細胞術的檢測結果均表明,hUC-MSCs-Exo促進了自噬標志蛋白LC3B的表達明顯上調,表明hUC-MSCs-Exo能激活自噬信號通路。

MSCs-Exo在治療AKI方面起重要作用,促進了“無細胞療法”的發展[13]。MSCs-細胞外囊可以通過抑制氧化、凋亡和炎癥及調節血管生成、細胞周期、再生、自噬和增殖來緩解AKI[14-15]。研究表明,hUC-MSCs-Exo通過抑制MAPK/ERK信號通路的激活,從而抑制HKC凋亡[16]。hUC-MSCs-Exo通過上調miR-146b水平,從而抑制核因子κB活性和減輕炎癥反應,明顯降低膿毒癥相關AKI小鼠的血清肌酐和血尿素氮,抑制腎小管細胞凋亡,提示hUC-MSCs-Exo可能是減少膿毒癥相關AKI的一種全新治療藥物[17]。干細胞分泌的胞外小泡攜帶miRNA并輸送到腎細胞中,對AKI模型發揮抗炎、抗凋亡和抗纖維化作用[18]。研究發現,hUC-MSCs-Exo通過攜帶miR-21,抑制p38 MAPK信號通路,減輕胰島內皮細胞內質網應激,從而保護胰島內皮細胞免受缺氧誘導的細胞凋亡[19]。本研究中,hUC-MSCs-Exo處理HKC后凋亡率由(11.37±1.70)%下降到(7.72±0.38)%,表明hUC-MSCs-Exo能通過增強細胞自噬而減緩TM誘導的細胞凋亡。干細胞釋放的Exo中包含與自噬調控密切相關的多種miRNA,如miR-181-5p、miR-29、miR-30d-5p、miR-221/222等[20-21]。

綜上所述,MSCs-Exo通過誘導HKC自噬上調而抑制細胞凋亡,但目前關于自噬與AKI的研究尚屬起步階段,Exo中誘導和調節自噬的關鍵信號通路尚未闡明,探究Exo中的分子對自噬的靶向調控將是接下來的研究重點。