雌馬酚對非酒精性脂肪性肝細胞模型的氧化應激作用研究*

崔涵強,倪向敏,張貴明,徐 喆,李 碩,王 建

(陸軍軍醫大學第二附屬醫院營養科,重慶 400037)

非酒精性脂肪性肝病(nonalcoholic fatty liver disease,NAFLD)包括單純性脂肪肝、脂肪性肝炎、脂肪性肝硬化,晚期可發展為肝癌,現已成世界范圍內慢性肝病的重要病因之一。我國NAFLD發病率呈上升趨勢,NAFLD已成為一項重大的公共衛生問題[1-2]。NAFLD發病機制復雜,氧化應激是NAFLD發病的重要環節[3]。因此,緩解肝臟的氧化應激反應,可為防治NAFLD帶來新思路。核因子E2相關因子(nuclear factor-E2 related factor 2,Nrf2)與氧化應激和炎癥反應關系密切。Nrf2是調控氧化應激反應的關鍵因子,被激活后可以從細胞質轉移至細胞核中,促進其下游的抗氧化基因血紅素加氧酶-1(heme oxygenase 1,HO-1)、醌氧化還原酶(NADPH quinone oxidoreductase 1,NQO1)等表達,發揮抗氧化效應[4]。有研究表明,Nrf2在被敲除后可加速肥胖和NAFLD發病[5],Nrf2信號通路的激活通過改善氧化應激對NAFLD發揮保護作用[6-7]。

雌馬酚(Equol,Eq)是大豆異黃酮類物質在體內的一種特定代謝產物,具有較強的抗氧化作用[8-9],但Eq能否通過調節Nrf2信號通路緩解NAFLD尚不清楚。本研究旨在通過體外NAFLD模型探討Eq能否緩解氧化應激及改善NAFLD,并探討其可能的機制。

1 材料與方法

1.1 材料

BRL3A細胞、DMEM基礎培養基、胎牛血清購于武漢普諾賽生命科技有限公司;Eq購于大賽璐藥物手性技術有限公司;油酸鈉(NaOL)購于西安鯤創科技發展有限公司;尼羅紅脂肪熒光染色液購于北京普利萊基因技術有限公司;放射免疫沉淀法(radio immunoprecipitation assay,RIPA)裂解液、二喹啉甲酸蛋白濃度測定試劑盒、過氧化氫酶(catalase,CAT)檢測試劑盒、活性氧(reactive oxygen species,ROS)檢測試劑盒、超敏增強化學發光(enhanced chemiluminescence,ECL)試劑盒、cDNA第一鏈合成試劑盒購于上海碧云天生物技術有限公司;甘油三脂(triglyceride,TG)、總膽固醇(total cholesterol,TC)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、丙二醛(malondialdehyde,MDA)檢測試劑盒購于南京建成生物工程研究所;細胞核蛋白抽提試劑盒、總RNA提取試劑盒、HO-1抗體、NQO1抗體、LaminB1抗體、GAPDH抗體、過氧化物酶耦聯的二抗、引物購于生工生物工程(上海)股份有限公司;Nrf2抗體、SYBR Green Fast qPCR Mix試劑盒購于武漢愛博泰克生物科技有限公司;全波長多功能酶標儀購于美國THERMO公司;倒置熒光顯微鏡購于日本奧林巴斯公司;超靈敏化學發光成像系統FluorQuant AC600購于美國ACURONBIO公司;CFX connect聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction,PCR)儀購于美國Bio-rad公司。

1.2 方法

1.2.1細胞培養

BRL3A細胞培養于含10%胎牛血清、1%雙抗DMEM培養基中,置于37 ℃、5% CO2的恒溫培養箱中。根據細胞生長情況,每2～3天更換培養液,當細胞生長密度到80%～90%時,用0.25%胰蛋白酶消化收集細胞并按1∶3傳代。

1.2.2細胞活力檢測

以2.0×104個/孔細胞量接種于96孔板中,待細胞貼壁后,將NaOL和Eq以濃度梯度分組給藥,繼續培養24 h,根據CCK-8試劑盒說明書測定細胞活力。

1.2.3細胞干預與分組

將BRL3A細胞接種于6孔板中,2×105個細胞/孔,分為正常對照組(Con,正常培養基培養)、模型組(Mod,0.48 mmol/L的NaOL造模),以及Eq低、中、高劑量干預組(Eq-L、Eq-M、Eq-H,分別采用0.1、1.0、10.0 μmol/L的Eq干預24 h)。細胞貼壁后采用無胎牛血清的培養基饑餓8 h后進行相應干預。

1.2.4細胞TG、TC含量測定

干預結束后,收集細胞于EP管中,加入磷酸緩沖鹽溶液(PBS),超聲裂解細胞后取細胞勻漿進行測定。具體操作步驟按測定試劑盒說明書進行。

1.2.5尼羅紅染色

干預結束后,去除培養基,采用4%多聚甲醛固定10 min,蒸餾水漂洗3次,尼羅紅染色工作液染色10 min,PBS清洗兩次,于倒置熒光顯微鏡(激發光492～577 nm)觀察細胞脂質蓄積情況,采用Image J軟件進行熒光強度分析。

如表5所示，統計1990-2018年刊載情報信息機構知識服務研究成果的文獻刊物來源，排在第1位的刊物是《圖書情報工作》，文獻數量為24篇，《情報理論與實踐》位列第2位，文獻數量為11篇，《情報雜志》和《情報探索》排在第3位和第4位，刊載的文獻數量分別為8篇和7篇列出了刊載知識服務文獻數量最多的前十位來源期刊。這些刊物對于我國普及知識服務理論知識，推廣各單位的工作實踐成果和經驗發揮了重要的作用，也是從業工作者獲取相關信息的重要渠道。

1.2.6細胞內氧化應激指標測定

測定細胞內ROS水平時,去除培養基,采用PBS漂洗3次,加入含有10 μmol/L的DCFH-DA熒光探針無胎牛血清培養基,37 ℃孵育30 min。采用無胎牛血清培養基洗滌2次并收集細胞,熒光酶標儀檢測熒光值,激發光為488 nm,發射光為535 nm。測定細胞內SOD、MDA、CAT水平時,在干預結束后將細胞收集于EP管中,加入PBS,超聲裂解細胞,4 ℃、12 000 r/min離心10 min,取上清液測定SOD、MDA、CAT水平,具體操作步驟按測定試劑盒說明書進行。

1.2.7蛋白質印跡法(Western blotting)檢測

干預結束后將細胞收集至EP管中,加入含1 mmol/L PMSF的RIPA裂解液,采用超聲裂解細胞,然后以4 ℃、12 000 r/min離心10 min,提取細胞總蛋白。根據試劑盒說明書提取細胞核蛋白。各組取等量蛋白樣品,采用10% SDS-聚丙烯酰胺凝膠進行電泳,電泳結束進行轉膜、封閉,一抗4 ℃孵育過夜,洗滌后加入二抗,室溫孵育1 h,充分洗滌。最后采用化學發光成像系統進行蛋白顯影,采用Image J軟件進行灰度值分析。

1.2.8qPCR檢測

表1 引物序列

1.3 統計學處理

2 結 果

2.1 不同濃度的NaOL和Eq對細胞活力的影響

與Con組比較,當NaOL濃度到達0.72 mmol/L時,細胞活力明顯下降,差異有統計學意義(P<0.05);與Con組比較,當Eq濃度達到100 μmol/L時,細胞活力明顯受到抑制(P<0.05),見圖1。

A:不同NaOL濃度對細胞活力的影響;B:不同Eq濃度對細胞活力的影響;a:P<0.05,與Con組比較。

2.2 各組細胞內脂質水平比較

與Con組比較,Mod組細胞內TG、TC水平明顯升高,差異有統計學意義(P<0.05);與Mod組比較,Eq干預各組細胞內TG、TC水平明顯降低,差異有統計學意義(P<0.05),且呈現出一定的劑量效應,見圖2。與Con組比較,Mod組細胞內紅色熒光較強;與Mod組比較,Eq干預各組細胞內紅色熒光強度較弱,隨著Eq濃度的增高,細胞內熒光強度逐步減弱,差異有統計學意義(P<0.05),見圖3。

A:各組TG水平;B:各組TC水平;a:P<0.05,與Con組比較;b:P<0.05,與Mod組比較。

A:Con組細胞內脂質累積情況;B:Mod組細胞內脂質累積情況;C:Eq-L組細胞內脂質累積情況;D:Eq-M組細胞內脂質累積情況;E:Eq-H組細胞內脂質累積情況;F:各組熒光強度分析;a:P<0.05,與Con組比較;b:P<0.05,與Mod組比較。

2.3 各組細胞內氧化應激指標的比較

與Con組比較,Mod組細胞內ROS水平明顯升高,差異有統計學意義(P<0.05);與Mod組比較,Eq干預各組細胞內ROS水平逐漸降低,差異有統計學意義(P<0.05),并呈現出一定劑量效應,見圖4A。與Con組比較,Mod組細胞內的MDA水平明顯升高,SOD、CAT水平明顯降低,差異均有統計學意義(P<0.05);與Mod組比較,Eq干預各組細胞內SOD、CAT水平升高,Eq-M、Eq-H組細胞內MDA水平降低,差異有統計學意義(P<0.05),見圖4B～D。

A:各組ROS水平;B:各組SOD水平;C:各組MDA水平;D:各組CAT水平;a:P<0.05,與Con組比較;b:P<0.05,與Mod組比較。

2.4 各組細胞Nrf2、HO-1、NQO1蛋白表達水平

與Con組比較,Mod組Nrf2(nucleus)、HO-1、NQO1表達水平明顯降低,差異有統計學意義(P<0.05);與Mod組比較,Eq干預各組Nrf2(nucleus)、HO-1、NQO1表達水平明顯升高,差異有統計學意義(P<0.05),且Eq隨濃度的增高呈逐步上升趨勢,見圖5。

A:Western blotting結果;B:Nrf2蛋白分析結果;C:HO-1蛋白分析結果;D:NQO1蛋白分析結果;a:P<0.05,與Con組比較;b:P<0.05,與Mod組比較。

2.5 各組細胞Nrf2、HO-1、NQO1 mRNA表達水平

與Con組比較,Mod組Nrf2、HO-1、NQO1 mRNA表達水平明顯下調,差異有統計學意義(P<0.05);與Mod組比較,Eq干預各組Nrf2和HO-1 mRNA表達水平明顯上調,Eq-M、Eq-H組NQO1 mRNA表達水平明顯上調,差異有統計學意義(P<0.05),見圖6。

A:Nrf2 mRNA相對表達量;B:HO-1 mRNA相對表達量;C:NQO1 mRNA相對表達量;a:P<0.05,與Con組比較;b:P<0.05,與Mod組比較。

3 討 論

隨著人們生活水平的提高、飲食結構和生活方式的改變,以及影像診斷技術的發展,NAFLD的發病率日益增高。目前,尚無特異性治療NAFLD的藥物,控制飲食和改善生活方式是NAFLD防治的基礎,但多數人難以長期堅持[10]。研究表明,食用大豆食品對NAFLD具有保護作用,這種有益作用可能歸因于其代謝產生的大豆異黃酮[11]。Eq是大豆異黃酮在體內的代謝產物,在動脈粥樣硬化、癌癥、圍絕經期癥狀和骨質疏松等方面具有保護效應[12]。據報道,Eq可以減輕多種細胞和組織中的氧化應激和細胞損傷[13-14],而且它在所有已知的異黃酮類中具有較強的抗氧化活性[15]。氧化應激反應對NAFLD的發展具有促進作用,Nrf2與氧化應激反應密切相關,但是目前還沒有研究報道Eq是否可以調控Nrf2信號通路及對NAFLD發揮保護作用。本研究通過BRL3A細胞建立體外NAFLD模型,研究Eq對細胞內氧化應激的作用和機制。

本研究發現,Mod組細胞內TG、TC、ROS、MAD水平升高,SOD、CAT水平降低,Nrf2信號通路相關蛋白和mRNA表達降低,表明體外NAFLD氧化應激細胞模型建立成功。Eq干預后可見細胞內脂滴明顯減少,TG、TC水平降低,提示Eq對NAFLD具有保護作用。ROS可誘導多種炎癥細胞因子表達,促進氧化應激,形成炎癥-壞死循環,加重肝組織損傷[16]。SOD和CAT是細胞內重要的抗氧化酶,能夠有效清除自由基及ROS,抑制過氧化反應,發揮保護作用。MDA為自由基參與脂質過氧化反應產生的毒性物質,其表達過多可嚴重破壞細胞膜結構,引起細胞腫脹、壞死,加重細胞損傷[17]。本研究結果表明,Eq可以降低細胞內ROS的產生和MDA水平,提高抗氧化酶SOD和CAT活性,且隨著Eq濃度增高,細胞抗氧化能力不斷增強。GOU等[18]的研究表明,Eq可通過降低MDA和增加SOD、CAT表達,抑制脂多糖誘導的細胞內氧化應激反應;CHOI等[19]研究發現,Eq可以提高HepG2細胞內SOD、CAT水平,發揮抗氧化作用。這與本研究結果一致,提示Eq可通過抗氧化作用,減輕NAFLD體外模型中氧化應激的進展,發揮肝保護作用。

Nrf2通路是機體抵御氧化應激的重要信號通路。在生理條件下,Nrf2主要存在與細胞質中,在受到親電體或氧化應激刺激后,Nrf2轉移到細胞核,促進下游抗氧化反應原件和各種抗氧化酶的表達[20]。HO-1可以通過催化血紅素降解為膽綠素Ⅸα、一氧化碳和鐵,調節氧化還原反應,還具有抗炎和抗細胞凋亡作用[21];NQO1可以催化內源和外源苯醌化合物及其衍生物的電子還原,同時具有抗炎與抗腫瘤作用[22]。ZHANG等[23]研究發現,Eq可上調Nrf2在小鼠主動脈組織和人臍靜脈內皮細胞中的表達,發揮抗氧化和抗動脈粥樣硬化作用;WIDYARINI等[24]研究發現,Eq可以通過上調HO-1表達,呈劑量依賴地抑制紫外線誘導小鼠皮膚中的脂質過氧化。本研究結果顯示,Mod組細胞中的Nrf2、HO-1和NQO1蛋白和mRNA表達均下降,推測為氧化應激條件下細胞損傷,蛋白合成受到抑制,Eq可以上調上述Nrf2及其下游蛋白表達和mRNA合成,提示Eq是通過激活Nrf2信號通路發揮其抗氧化作用。

綜上所述,本研究發現,大豆異黃酮類物質Eq對體外NAFLD細胞具有保護作用,可以減輕脂質累積,并通過激活Nrf2信號通路,抵抗細胞內氧化應激,這對異黃酮類物質在肥胖人群中的應用和膳食指導有重要意義。本研究仍值得改進,Eq是通過何種分子信號介導激活Nrf2通路產生影響仍不清楚,Eq的保護作用仍需在體內和人群試驗中得到進一步驗證。