血清HBV RNA的臨床研究進展

陳芬蘭 程計林 林文 陳麗萍

作者單位：350300 福建醫科大學附屬福清市醫院感染科(陳芬蘭,林文);復旦大學附屬公共衛生臨床中心消化科(程計林,陳麗萍);上海交通大學醫學院附屬仁濟醫院消化科(陳麗萍)

乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)的慢性感染可導致慢性肝炎、肝硬化,甚至肝癌的發生。共價閉合環狀DNA(covalently closed circular DNA,cccDNA)在肝臟細胞內的持續存在是HBV難以清除進而持續性感染的主要原因。另外,作為最關鍵的細胞內復制中間體,HBV cccDNA的存在和轉錄活性也是評價抗病毒治療效果最直接有效的指標。但是,檢測cccDNA需要通過肝穿刺活組織檢查,在臨床實踐中不便廣泛開展,進一步探究可以代替的血清學指標尤為關鍵。前基因組RNA(pregenomic RNA,pgRNA)作為cccDNA的直接轉錄產物,可以反映cccDNA轉錄活性,同時它作為病毒逆轉錄的模板,是目前唯一一種可以在外周血中檢測出來的HBV RNA。眾多研究表明[1-3],即使在HBV DNA低于檢測下限、甚至乙肝表面抗原(HBsAg)轉陰后的HBV感染者血清中HBV RNA仍存在。因此,相較于HBV DNA等指標,HBV RNA在評估抗乙肝病毒療效、選擇停藥時機及預測停藥后復發風險等方面均具有較高的臨床價值。近年來,不同于以血清HBsAg丟失為特征的“功能性治療”[4],基于血清HBV RNA的持續丟失與cccDNA的消除或轉錄沉默相關的“超功能治療”得到越來越多的關注[5]。現就目前HBV RNA與臨床指標相關性、評估抗病毒療效、指導臨床用藥等相關研究進展作一綜述。

一、HBV的復制機制及血清HBV RNA的來源

HBV侵入正常肝臟細胞后脫去核衣殼成為松弛環狀雙鏈DNA(relaxed circular DNA,rcDNA),rcDNA進入肝細胞核后,在DNA聚合酶作用下填補缺口,進行扭轉、折疊等過程,成為具有超螺旋結構的HBV cccDNA;接著以HBV cccDNA為模板,分別轉錄出0.7、2.1、2.4、3.5kb四種不同長度的mRNA,再合成多種病毒蛋白。其中3.5kb的RNA有兩種表達模式[6],一種為可編碼乙肝e抗原(HBeAg)相關蛋白的pre-CmRNA,另一種即為逆轉錄模板的pgRNA。pgRNA主要有兩個去處:一部分可利用逆轉錄酶再逆轉錄合成rcDNA中的負鏈,后者在DNA聚合酶(P蛋白,也是由pgRNA翻譯而成)引導下合成正鏈DNA,然后正、負鏈DNA重新組合成為新的HBV rcDNA。新合成的HBV rcDNA可以再次進入肝細胞核轉化成為新的HBV cccDNA,還可以與病毒蛋白重新組裝后釋放到肝細胞外,成為有完整病毒顆粒的HBV DNA,再感染新的正常肝細胞。另一部分pgRNA經過衣殼組裝和病毒包膜蛋白包被釋放入血,研究已證實有包膜的血清HBV RNA主要由pgRNA組成[1, 2, 7],表達于HBV相關性肝病患者的血清中,故常規提及的血清HBV RNA實際上指的就是血清中的pgRNA,作為直接轉錄產物及逆轉錄的模板的新型血清學標志物,pgRNA特殊性被日益重視。

二、與臨床指標的相關性

Wang等[1]認為血清HBV pgRNA與轉氨酶、血清HBV DNA、HBsAg、乙型肝炎核心相關抗原(HBcrAg)有一定相關性,但其相關性受HBeAg狀態和丙氨酸氨基轉移酶(ALT)水平的影響;Gu等[8]發現,與ALT正常患者(≤40 IU/mL)相比,ALT升高(>40 IU/mL)患者血清HBV pgRNA水平明顯升高。

Butler等[9]發現在對慢乙肝患者進行核苷(酸)類似物(NA(s))治療期間,血清中HBV DNA與pgRNA水平關聯性低,血清pgRNA濃度普遍高于HBV DNA濃度;而沒有應用NA(s)治療時,HBV DNA與pgRNA水平相關性高,血清pgRNA濃度大約比HBV DNA低2logIU/mL。

Chan等[10]的研究發現,HBsAg<100 IU/mL的患者血清HBV pgRNA檢出率低,Huang等[11]認為在HBeAg(+)患者中,血清HBV pgRNA與HBsAg呈正相關,而在HBeAg(-)患者中血清HBV pgRNA與HBsAg無相關性。然而,另一項來自北美的隊列研究[12]發現未治療的慢乙肝患者中,無論是HBeAg(+)或是HBeAg(-),HBV RNA 與HBcrAg、HBV DNA呈中度相關聯,并且在HBeAg(-)患者中,HBV RNA、HBcrAg與ALT、肝纖維化指標水平呈高度正相關。

有研究發現[13],經過 3 年的抗病毒治療后,即使血清 HBV DNA 保持陰性,但分別有近1/3的患者血清可檢測到HBcrAg和 HBV RNA,甚至在HBV DNA、HBsAg均為陰性時,患者血清HBV pgRNA均存在陽性[5]。Wang等[1]的研究還發現,血清HBcrAg水平是HBV pgRNA低于檢測下限的獨立預測因子,最佳截斷值為6.6log10U/mL。Wang等[14]的研究發現,基線時肝內cccDNA和血清中RNA水平呈正相關,但是NA(s)治療48周發生HBeAg轉換后,血清中RNA與cccDNA水平再無相關性,這可能與NA(s)的作用機制相關,抗病毒后干擾了HBV正常生命周期所導致。

三、評估抗病毒藥物療效及血清學轉換

抗HBV治療過程中,常規說來血清HBV DNA水平的下降代表了病毒被有效抑制,DNA水平很快下降至低于檢測下限即實現了病毒學應答,但DNA水平無法準確反應HBV cccDNA狀態。有觀點認為,NA(s)治療可降低HBV DNA,但是HBV RNA卻升高[15];然而,也有觀點認為,NA(s)也可以降低血清HBV RNA[16],只不過RNA下降較DNA慢[14]。所以對于評估抗病毒藥物療效,結合血清HBV RNA的測定具有更好的指導作用[17]。慢乙肝患者經長期NA(s)抗病毒治療后的血清學抗原狀態可能與血清HBV pgRNA的存在及表達量有關,HBV pgRNA的持續存在可能是導致HBsAg持續高水平及HBeAg血清轉換率低的原因。Chan等[10]發現HBsAg<100 IU/mL且HBeAg發生血清學轉換的患者,其血清HBV pgRNA檢出率很低,表明這類患者肝內HBV cccDNA轉錄活性處于抑制狀態,因此這部分人群是實現HBV功能性治愈的最佳優勢人群。Luo等[18]的研究表明,慢乙肝患者在NA(s)治療前血清HBV RNA水平低于4.12log10copies/mL時,可實現HBeAg血清轉化,且HBV pgRNA的高載量與實現HBeAg清除失敗的高風險相關,NA(s)治療48周后HBV pgRNA仍為陽性的患者,HBeAg轉陰失敗的概率高,這些患者需要更長的時間實現HBeAg轉陰及HBV DNA轉陰[18]。Van等[19]研究發現,在抗病毒治療后出現血清HBeAg陰轉的患者中,血清HBV RNA水平在治療的第12周、24周均下降明顯,且相比于HBV DNA、HBsAg等標志物變化,治療后第12周、24周血清HBV RNA水平的下降對于預測HBeAg的血清學轉換具有更好的預測價值。HBeAg陰性和基線較低的HBV pgRNA水平是ETV治療后早期病毒學應答的獨立預測指標[20]。

在評價干擾素治療效果方面,血清HBV RNA可能更好地反映干擾素抑制病毒復制的情況,同時對免疫學應答有預測作用[21]。Jia等[22]的研究表明,對于初治HBeAg陽性的患者基線時HBV RNA>200000拷貝/mL,干擾素治療12周后HBV RNA>3000拷貝/mL,在治療24周時很難實現血清學轉換,以此來預測干擾素治療獲益。

另外,HBV RNA可以聯合其他指標來評估HBeAg(+)乙肝患者抗病毒療效。Huang等[23]認為在HBeAg陽性的慢性HBV感染者中,血清HBV DNA聯合RNA比單獨血清HBV RNA或DNA能更好地反映肝內cccDNA活性,這可能與HBeAg陽性患者的cccDNA轉錄活性較高、HBV基因型、HBV基礎核心啟動子突變、HbeAg陰性患者病毒的增殖力受損等有關[20]。總之,檢測HBV RNA水平有助于治療效果的判斷,從而優化抗HBV治療選擇。

四、預測停藥后病毒反彈風險

慢乙肝患者經治療達到標準停藥后易出現病毒反彈,多因素回歸分析發現[6],HBV pgRNA水平、ALT水平、停藥時HBsAg水平、HBV DNA水平均為慢性乙型肝炎患者停藥復發的危險因素,而HBV pgRNA水平與停藥復發風險呈顯著非線性關系。Chen等[24]認為,對于高水平HBsAg的慢乙肝患者,即使發生HBeAg血清轉換, HBV pgRNA檢出率仍然較高,表明其肝內HBV cccDNA的轉錄活性仍比較活躍,HBV復制仍在進行。這就解釋了僅HBeAg血清轉換發生而HBsAg水平仍較高的患者,一旦停藥后復發率仍比較高的問題。有研究認為[13, 15], NA(s) 能夠通過抑制逆轉錄降低HBV DNA,但是卻使得RNA升高,這就導致了治療停藥后的病毒學反彈率和疾病復發率仍居高不下。

Huang等[11]對接受NA(s)治療的患者血清HBV pgRNA的動態變化進行了研究分析,發現血清HBV pgRNA水平可反映NA(s)的抗病毒效能。由于ETV比LAM能更有效地抑制反轉錄酶及HBV DNA的合成,所以接受ETV治療的患者血清HBV pgRNA峰值水平和檢出概率都顯著高于接受拉米夫定(LAM)治療的患者。Wang等[15]對33例治療結束時HBV DNA未檢出的慢乙肝患者血清HBV pgRNA進行檢測,其中21例CHB患者血清中HBV pgRNA仍呈陽性,且這些患者均在治療后24周出現病毒反彈,而另外12例HBV pgRNA檢測不到的患者中,僅3例患者出現病毒反彈。另一項研究發現,在ETV治療結束時,HBsAg≥2logIU/mL或HBV pgRNA≥1466拷貝/mL為停藥后病毒學復發的獨立預測因子[20]。另外,聯合指標作為預測因子的研究也日益增多,GUT刊文就RNA聯合HBsAg來確定是否可以停用ETV,研究顯示[25]血清RNA ≥44.6 U/mL的患者在停藥48周后93.25%會出現HBV DNA的反彈,而HBV RNA定量少到接近不可測且HBsAg <10 IU/mL 的患者僅有9.1%出現HBV DNA反彈。這都提示HBV pgRNA的高載量與停止NA(s)治療后病毒反彈的高風險關聯,應該作為指導NA(s)治療安全停藥的指標。

最近的研究結果[26, 27]顯示,由于HBV基因可整合到宿主基因組,整合的HBV DNA易發生突變、缺失、插入和重排,喪失轉錄成HBV pgRNA的能力,且某些整合的HBV基因片段仍可產生HBsAg,因此少數CHB患者在按照停藥標準停藥時,其血清HBsAg水平不能很好地反映肝細胞內cccDNA的狀態。血清HBsAg定量水平對NA(s)的治療結果預測價值不高,HBV pgRNA必須經過完整的cccDNA轉錄才能產生,所以理論上講,血清HBV pgRNA應作為指導臨床抗病毒用藥的指標,可在NA(s)停藥前檢測血清中的HBV pgRNA水平,對患者的復發風險進行預判,將有助于甄別出那些已達到病毒學應答并在停藥后能維持病毒學應答的“部分治愈”患者,從而實現安全停藥。

五、抗HBV藥物的選擇及新藥研發

目前臨床常用的NA(s)[15]雖然可以阻斷HBV DNA聚合酶參與的逆轉錄過程,但卻能夠導致HBV pgRNA水平升高。干擾素除了可以通過抑制HBV pgRNA的轉錄來抑制HBV復制,還可以介導巨噬細胞分泌外泌體,并攜帶miRNA-574-5p進入感染HBV的肝細胞[28],從而抑制HBV pgRNA的轉錄,降低肝細胞HBV cccDNA含量和HBsAg水平,所以近年來聯合兩者的治療方案也是不錯的選擇。

靶向作用于HBV復制周期的抗病毒藥物近來得到關注[29, 30],目前直接作用核心組裝調節劑(CAMs)的新型抗HBV藥物,對HBV復制周期有重要影響,可以干擾HBV復制周期的幾個步驟,包括cccDNA的形成、衣殼組裝、pgRNA和聚合酶包裝。目前,根據分子結構的不同,CAMs有三種類型,分別是雜芳基二氫嘧啶(HAP)、苯丙烯酰胺(PPA)和磺胺酰基苯甲酰胺(SBA)衍生物,相關研究正在開展。除此之外,現在有多種siRNA分子抑制劑可以降低病毒mRNA和pgRNA的表達。然而,將HBV特異性siRNA在體內傳遞給所有感染的肝細胞仍然是個挑戰[31]。

六、展望

既往評估慢乙肝病情指標主要局限于HBV DNA、HBeAg、ALT、HBsAg、肝組織學等的改變,雖然經抗病毒治療后部分指標可恢復正常,但停藥后易出現病毒反彈;HBsAg發生血清學轉換后,并不意味著病情完全緩解, 患者肝內仍殘留cccDNA,進一步導致肝細胞發生病變。因此,血清HBV RNA水平可作為HBV cccDNA水平的替代檢測,綜合評估抗病毒療效和預測治療終點,并為臨床抗HBV治療、選擇合適的停藥時機及分析預后提供有意義的個體化指導。另外,針對包括HBV pgRNA在內的HBV復制機制的新藥設計,即研發針對HBcAg生成和核衣殼裝配的抗病毒藥物可能會為未來HBV的治愈帶來曙光。

利益沖突聲明：所有作者均聲明不存在利益沖突。