高效液相色譜法分離純化達托霉素

王 月,栗婷婷,李曉露,高月麒,安蘭蘭,程啟東

(1.華北制藥集團新藥研究開發有限責任公司 微生物藥物國家工程研究中心 河北省工業微生物代謝技術創新中心,河北 石家莊 052165;2.華北制藥華勝有限公司,河北 石家莊 052160)

達托霉素為玫瑰孢鏈霉菌發酵產生的一種脂肽類抗生素,早期由美國Lilly公司開發生產,由13個氨基酸組成的環狀β-氨基酸肽鏈N-末端的L-色氨酸與1個十碳癸酸連接而成(圖1)[1]。達托霉素對革蘭氏陰性菌無效,但由于其獨特的Ca2+濃度依賴的作用機制對具有多重耐藥性的革蘭氏陽性菌具有良好的抑制作用[2],極大程度上解決了耐藥菌的感染問題。這也使達托霉素作為復雜的皮膚感染和金黃色葡萄球菌感染的菌血癥和心內膜炎的治療藥物在臨床上得到了青睞[3]。

圖1 達托霉素的化學結構式 Fig.1 Chemical structure of Daptomycin

目前,達托霉素的生產方法主要是微生物發酵法,產物體系中次級代謝產物復雜,從來源上決定了達托霉素分離純化難度大;而且因為達托霉素穩定性較差,在純化過程中易受pH值、溫度的影響產生脫水達托霉素和β-異構達托霉素等多種雜質[4],導致達托霉素的分離純化難度進一步加大。雖然目前關于達托霉素分離純化國內外已有大量研究,主要方法有溶媒萃取、離子交換、色譜分離、膜分離、大孔樹脂分離和結晶等[5-7],但是,隨著國際高端市場對產品雜質限度要求越來越嚴格,應用上述方法進行達托霉素分離純化往往難以達到要求。為了開發出一種收率高、產品質量優良的高效液相色譜純化工藝,作者采用高效液相色譜法對達托霉素粗品進行純化,對反相硅膠種類、洗脫劑濃度、洗脫速度、上樣量進行優選,并對關鍵雜質進行質量控制,以期得到滿足高端客戶要求的達托霉素產品。

1 實驗

1.1 材料、試劑與儀器

達托霉素發酵液(發酵單位2 060 μg·mL-1),自制;反相硅膠UniSil C18、UniSil C18 Ultra、UniSil C8,蘇州納微科技股份有限公司。

乙醇、乙腈為制備級,其它試劑均為分析純。

e2695型分析液相色譜系統,Waters公司;NP7000型制備液相色譜系統,漢邦科技有限責任公司;Loborata 4000型旋轉蒸發器,Heidolph公司;XSR105 DualRange型分析天平,Mettler Toledo公司;SCIENTZ-30F/A型冷凍干燥機,寧波新芝生物科技股份有限公司。

1.2 達托霉素粗品的制備

將達托霉素發酵液調pH值至2.0～4.5,經陶瓷膜過濾得到澄清濾液;濾液過D312大孔吸附樹脂柱,用一定濃度的乙醇洗脫,收集達托霉素濃度大于200 μg·mL-1的解吸液;將解吸液減壓濃縮,調節濃縮液pH值至6.5,上樣于NMQ陰離子交換樹脂層析柱,用含鹽水溶液進行梯度洗脫,根據色譜峰收集洗脫液;洗脫液經納濾、濃縮、結晶、干燥,得到達托霉素粗品。

1.3 達托霉素粗品的純化

將一定質量的達托霉素粗品,用適量水溶解后加入2%氯化鈉,上樣于反相硅膠色譜柱,收集洗脫液;將洗脫液用10%的醋酸調pH值至6.0～6.2,經濃縮、凍干,得到達托霉素精粉。

對達托霉素粗品純化過程中的反相硅膠種類、洗脫劑濃度、洗脫速度、上樣量進行優選。

1.4 色譜條件

分析液相色譜系統:Phenomenex IB-Sil C8色譜柱(4.6 mm×250 mm,5 μm),流動相為0.45%磷酸二氫銨溶液(用磷酸調節pH值至3.25)-乙腈(67∶33,體積比),流速1.5 mL·min-1,檢測波長214 nm,柱溫30 ℃,進樣量20 μL。

2 結果與討論

2.1 反相硅膠種類的選擇

分別取預處理好的反相硅膠UniSil C18、UniSil C18 Ultra、UniSil C8各100 mL,按重力沉降法裝柱,用2%～3%的乙醇平衡系統。

準確稱取達托霉素粗品1.0 g,用適量水溶解后加入2%氯化鈉,分別上樣于3種反相硅膠色譜柱;然后用0%～80%的乙醇梯度洗脫,制備液相色譜檢測器在線監測,根據色譜圖收集洗脫液;合并達托霉素HPLC含量大于98.5%的洗脫液,計算洗脫收率,結果見表1。

表1 反相硅膠種類對達托霉素洗脫收率的影響(n=3)

由表1可知,UniSil C18 Ultra反相硅膠色譜柱的pH使用范圍最廣,達托霉素的洗脫收率最高。故,選擇UniSil C18 Ultra反相硅膠色譜柱純化達托霉素。

2.2 洗脫劑濃度的選擇

實驗發現,洗脫劑乙醇濃度在6%～12%時,主產物被集中洗脫。為進一步確定乙醇濃度,選擇反相硅膠UniSil C18 Ultra裝柱,按2.1方法分別采用6%、8%、10%、12%的乙醇進行等度洗脫,分管收集洗脫液,合并達托霉素HPLC含量大于98.5%的洗脫液,計算洗脫收率,結果見表2。

表2 洗脫劑濃度對達托霉素洗脫收率的影響(n=3)

由表2可知,用6%、8%的乙醇洗脫時,洗脫液中主要是極性大的雜質;用10%乙醇洗脫時,雜質去除率高,達托霉素的分離純化效果最好,達托霉素HPLC含量和洗脫收率均達到最高;用12%乙醇洗脫時,極性小的雜質與達托霉素一同洗脫下來,達托霉素HPLC含量和洗脫收率有所降低。因此,選擇10%乙醇作為洗脫劑。

2.3 洗脫速度的選擇

選擇反相硅膠UniSil C18 Ultra裝柱、10%乙醇作為洗脫劑,按2.1方法分別以洗脫速度14 mL·min-1、16 mL·min-1、18 mL·min-1、20 mL·min-1進行等度洗脫,分管收集洗脫液,合并達托霉素HPLC含量大于98.5%的洗脫液,計算洗脫收率,結果見表3。

表3 洗脫速度對達托霉素洗脫收率的影響(n=3)

洗脫速度慢則分離純化耗時較長。由表3可知,隨著洗脫速度的加快,達托霉素洗脫收率先升高后降低;當洗脫速度為16 mL·min-1時,洗脫收率達到最高;當洗脫速度為18 mL·min-1時,洗脫收率略微下降。綜合考慮,選擇洗脫速度為16～18 mL·min-1。

2.4 上樣量的選擇

選擇反相硅膠UniSil C18 Ultra裝柱、10%乙醇作為洗脫劑、洗脫速度16～18 mL·min-1,上樣量分別為8 mg·mL-1、10 mg·mL-1、12 mg·mL-1、14 mg·mL-1,按2.1方法進行洗脫,分管收集洗脫液,合并達托霉素HPLC含量大于98.5%的洗脫液,計算洗脫收率,結果見表4。

表4 上樣量對達托霉素洗脫收率的影響(n=3)

由表4可知,當上樣量小于10 mg·mL-1時,樣品分散程度好,但填料利用率低,成本高;當上樣量大于12 mg·mL-1時,色譜峰變寬,目標物與雜質交叉嚴重,HPLC含量和洗脫收率均降低。因此,在保證分離度的前提下,選擇上樣量為10～12 mg·mL-1。

2.5 精粉制備與含量測定

取達托霉素粗品20.0 g,在上述優選純化條件(反相硅膠UniSil C18 Ultra裝柱,洗脫劑為10%乙醇,洗脫速度為16～18 mL·min-1,上樣量為10～12 mg·mL-1)下,使用DAC100(2L)色譜柱制備液相色譜進行放大實驗。采用HPLC法檢測達托霉素含量,合并合格洗脫液,用10%的醋酸將洗脫液pH值調至6.0～6.2,濃縮、凍干,得到達托霉素精粉14.2 g,HPLC含量99.2%,HPLC圖譜見圖2。

圖2 達托霉素精粉的HPLC圖譜Fig.2 HPLC spectrum of Daptomycin fine powder

2.6 工藝驗證

在優選純化條件下進行3次驗證實驗,按色譜條件測定達托霉素HPLC含量,計算收率;并測定達托霉素精粉中有關物質含量,結果見表5。

表5 達托霉素純化工藝驗證(n=3)

由表5可知,在優選純化條件下,達托霉素精粉中有關物質含量均低于企業內控標準,HPLC含量超過99.0%,收率超過70.0%。表明優選純化條件分離效果好,可實現連續制備,并能夠精準把控關鍵雜質。

3 結論

采用高效液相色譜法分離純化達托霉素。以反相硅膠UniSil C18 Ultra裝柱、以10%乙醇為洗脫劑、洗脫速度為16～18 mL·min-1、上樣量為10～12 mg·mL-1,在此條件下,達托霉素精粉的HPLC含量超過99.0%,收率超過70.0%。該方法分離制備效率高,有機溶劑用量少,純化精粉中的有關物質均滿足質量要求,為高質量達托霉素的規模化生產提供了重要參考,具有產業化應用前景。