響應面法優化毛菊苣總黃酮和總多酚的超聲提取工藝

律夢偉,劉鑫榕,蘭 衛*,武嘉林,2,3*

(1.新疆醫科大學中醫學院,新疆 烏魯木齊 830017;2.新疆醫科大學附屬中醫醫院,新疆 烏魯木齊 830002;3.新疆華世丹藥業股份有限公司,新疆 烏魯木齊 830011)

毛菊苣(CichoriumglandulosumBoiss.et Huet)為菊科菊苣屬草本植物,主要分布于我國新疆南疆地區,是當地居民常用藥材[1]。據記載,毛菊苣以地上部分入藥,性味苦寒,具有清肝、健胃、利尿等功效,主要用于治療黃疸、胃痛、水腫、尿少等病癥[2]。毛菊苣含有黃酮類、酚酸類、多糖類、萜類、苯丙素類等多種有效成分。現代藥理學研究表明,毛菊苣總黃酮和總多酚具有保肝、降糖、降脂、抗氧化、抗菌等作用,是治療非酒精性脂肪肝、糖尿病等的潛在活性成分[3-4]。因此,最大限度地提取毛菊苣總黃酮和總多酚意義重大。

目前,毛菊苣總黃酮或總多酚的提取主要采用回流法,其工藝優化以正交實驗為主,但提取效率普遍較低[5-7]。秦冬梅[8]采用乙醇回流法提取毛菊苣根中總黃酮,通過正交實驗優化提取工藝,在最佳條件下,毛菊苣浸膏得率為5.255%±0.052%,總黃酮得率為0.849%±0.027%。相較于回流提取法,超聲提取法具有設備簡單、溶劑用量少、對熱敏性成分友好、提取時間短、提取效率高等優點[9]。近年來,響應面法已廣泛應用于中藥有效成分提取工藝的優化,與正交實驗相比,具有建模速度快、目標組分得率高、回歸方程精密度高等優勢[10-11]。目前,關于毛菊苣地上部分總黃酮和總多酚的提取工藝優化尚未見報道。因此,作者以通過熵權法[12]計算的毛菊苣浸膏得率、總黃酮含量、總多酚含量的綜合評分為評價指標,采用響應面法對毛菊苣總黃酮和總多酚的超聲提取工藝進行優化,為毛菊苣總黃酮和總多酚的提取及相關產品的開發提供技術支持。

1 實驗

1.1 材料、試劑與儀器

毛菊苣,購自新疆昌吉吉木薩爾縣天郝成業中藥材種植合同社,由新疆醫科大學盛萍教授鑒定為菊科菊苣屬毛菊苣(CichoriumglandulosumBoiss.et Huet)的地上部分。

蘆丁標準品、沒食子酸標準品(純度≥98%,批號:A05GB145263、MUST-17041504),上海源葉生物科技有限公司;福林酚試劑,新疆醫科大學實驗室;無水乙醇、Na2CO3、NaOH、NaNO2、Al(NO3)3均為分析純。

722S型可見分光光度計,上海菁華科技儀器有限公司;AB135-S型電子分析天平,梅特勒-托利多儀器有限公司;KQ-3200DE型數控超聲波清洗器,昆山超聲儀器有限公司。

1.2 毛菊苣提取物的制備

將毛菊苣藥材粉碎,過4號篩(65目),備用。準確稱取2.00 g毛菊苣粉末于200 mL錐形瓶中,按一定料液比加入一定體積分數的乙醇,超聲提取一定時間,提取2次,合并提取液,抽濾,烘干,即得毛菊苣提取物。

1.3 毛菊苣浸膏得率、總黃酮含量、總多酚含量的測定

1.3.1 浸膏得率的測定

采用減重法測定毛菊苣浸膏得率。將蒸發皿洗凈晾干后置于60 ℃烘箱中干燥3.5 h,取出,冷卻至室溫,稱重;將毛菊苣提取物倒入干燥的蒸發皿中,水浴蒸干至提取物觸之不沾手,稱重。按下式計算浸膏得率:

式中:m2為蒸發皿和提取物烘干后的質量;m1為蒸發皿烘干后的質量;m0為毛菊苣粉末質量。

1.3.2 總黃酮含量的測定[13]

標準曲線的繪制:稱取15.00 mg蘆丁標準品,用60%乙醇溶解并定容至50 mL,得蘆丁標準溶液。分別吸取0.5 mL、1.0 mL、1.5 mL、2.0 mL、2.5 mL蘆丁標準溶液于10 mL容量瓶中,加入2 mL 60%乙醇;依次加入0.3 mL NaNO2溶液和0.3 mL Al(NO3)3溶液,混勻后靜置6 min;再加入4 mL NaOH溶液,用60%乙醇定容至刻度,靜置10 min,測定510 nm處吸光度;以60%乙醇代替蘆丁標準溶液為空白對照,同法操作,測定510 nm處吸光度。以蘆丁濃度(c,μg·mL-1)為橫坐標、 吸光度(A)為縱坐標繪制標準曲線,擬合得回歸方程:A=0.0119c+0.019,R2=0.9995。表明,蘆丁濃度在 15～75 μg·mL-1范圍內與吸光度線性關系較好。

取25.00 mg毛菊苣提取物,用60%乙醇溶解并定容于10 mL容量瓶中;吸取1.5 mL溶液,按上述方法測定510 nm處吸光度,依據標準曲線方程計算總黃酮含量。

1.3.3 總多酚含量的測定[13]

標準曲線的繪制:稱取5.00 mg沒食子酸標準品,用蒸餾水溶解并定容至50 mL,得沒食子酸標準溶液。分別吸取沒食子酸標準溶液0 mL、0.1 mL、0.2 mL、0.3 mL、0.4 mL、0.5 mL于10 mL容量瓶中,加入6 mL蒸餾水,搖勻;加入0.5 mL福林酚試劑,搖勻后靜置1 min;再加入20%Na2CO3溶液1.5 mL,用蒸餾水定容至刻度,75 ℃水浴10 min;冷卻至室溫,測定765 nm處吸光度。以沒食子酸濃度(c,μg·mL-1)為橫坐標、 吸光度(A)為縱坐標繪制標準曲線,擬合得回歸方程:A=0.1666c-0.0015,R2=0.9993。表明,沒食子酸濃度在0～5 μg·mL-1范圍內與吸光度線性關系較好。

取25.00 mg毛菊苣提取物,用蒸餾水溶解并定容于10 mL容量瓶中;吸取0.2 mL溶液,按上述方法測定765 nm處吸光度,依據標準曲線方程計算總多酚含量。

1.4 綜合評分的計算

由于總黃酮和總多酚極性相差不大,提取過程中會相互影響,因此以單一活性成分含量作為評價指標不合理;且浸膏得率能夠反映樣品的整體質量水平,因此以熵權法計算的浸膏得率和活性成分含量的綜合評分作為評價指標最為可靠[14]。根據熵權法進行賦權,得到毛菊苣浸膏得率、總黃酮含量、總多酚含量的權重值分別為0.521 2、0.238 4、0.240 4,綜合評分=浸膏得率×0.5212+總黃酮含量×0.2384+總多酚含量×0.2404。

1.5 提取工藝的優化

1.5.1 單因素實驗

采用單因素實驗,分別考察乙醇體積分數(40%、50%、60%、70%、90%)、超聲時間(20 min、30 min、40 min、50 min、60 min)、料液比(1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60,g∶mL,下同)對毛菊苣浸膏得率、總黃酮含量和總多酚含量的影響。每組實驗做3個平行。

1.5.2 響應面實驗

在單因素實驗的基礎上,以乙醇體積分數(A)、超聲時間(B)、料液比(C)為考察因素,以綜合評分為響應值,采用響應面法進一步優化毛菊苣總黃酮和總多酚的超聲提取工藝。

1.6 數據處理

分別采用Excel和Origin 2021版進行數據處理及繪圖,運用Design-Expert 12.0軟件進行響應面設計與分析。

2 結果與討論

2.1 單因素實驗結果

2.1.1 乙醇體積分數的選擇

在料液比為1∶30、超聲時間為30 min的條件下,考察乙醇體積分數對毛菊苣浸膏得率、總黃酮含量及總多酚含量的影響,結果如圖1所示。

圖1 乙醇體積分數對毛菊苣浸膏得率、總黃酮含量及總多酚含量的影響Fig.1 Effect of ethanol volume fraction on extract yield,total flavonoids content,and total polyphenols content of Cichorium glandulosum Boiss.et Huet

由圖1可知,隨著乙醇體積分數的增加,浸膏得率、總黃酮含量、總多酚含量及綜合評分均逐漸升高,當乙醇體積分數為60%時,四者均達到最高;繼續增加乙醇體積分數,總黃酮含量、總多酚含量及綜合評分均顯著降低,而浸膏得率降低后又升高,整體變化不明顯。這是因為,根據“相似相溶”原理,乙醇體積分數越大,其它脂溶性成分就越易溶出,而黃酮類和多酚類成分因極性較大在提取時就會受到抑制[15]。因此,乙醇體積分數對毛菊苣總黃酮和總多酚含量的影響較大,但對浸膏得率的影響不顯著。綜合考慮,選擇60%作為響應面實驗乙醇體積分數的中心點。

2.1.2 超聲時間的選擇

在料液比為1∶30、乙醇體積分數為60%的條件下,考察超聲時間對毛菊苣浸膏得率、總黃酮含量及總多酚含量的影響,結果如圖2所示。

圖2 超聲時間對毛菊苣浸膏得率、總黃酮含量及總多酚含量的影響Fig.2 Effect of ultrasonic time on extract yield,total flavonoids content,and total polyphenols content of Cichorium glandulosum Boiss.et Huet

由圖2可知,隨著超聲時間的延長,浸膏得率、總黃酮含量、總多酚含量及綜合評分均逐漸升高,當超聲時間為30 min時,四者均達到最高;繼續延長超聲時間,總黃酮含量明顯降低,而浸膏得率、總多酚含量及綜合評分略微降低后趨于穩定。可能是因為,超聲時間過長,毛菊苣中其它成分溶出,造成總黃酮含量明顯降低[16];而多酚類成分具有強抗氧化性,僅部分因為超聲時間過長被氧化,造成總多酚含量僅略微降低[17];總體導致浸膏得率也略微降低。綜合考慮,選擇30 min作為響應面實驗超聲時間的中心點。

2.1.3 料液比的選擇

在乙醇體積分數為60%、超聲時間為30 min的條件下,考察料液比對毛菊苣浸膏得率、總黃酮含量及總多酚含量的影響,結果如圖3所示。

圖3 料液比對毛菊苣浸膏得率、總黃酮含量及總多酚含量的影響Fig.3 Effect of solid-liquid ratio on extract yield,total flavonoids content,and total polyphenols content of Cichorium glandulosum Boiss.et Huet

由圖3可知,隨著料液比的減小,即提取溶劑用量的增加,浸膏得率、總黃酮含量、總多酚含量及綜合評分整體均逐漸升高,當料液比為1∶50時,四者均達到最高;繼續增加溶劑用量,浸膏得率、總黃酮含量及綜合評分降低,總多酚含量變化不大。可能是因為,溶劑用量增加,有利于細胞破碎和胞內物質溶出;但溶劑用量過大會使傳質效率降低,穿透細胞壁能力減弱,從而使溶出速率減慢[15,17]。綜合考慮,選擇1∶50作為響應面實驗料液比的中心點。

2.2 響應面實驗結果

2.2.1 響應面實驗設計與結果

響應面實驗的因素與水平見表1,設計與結果見表2。

表1 響應面實驗的因素與水平

表2 響應面實驗設計與結果(n=3)

2.2.2 回歸模型與方差分析

使用Design-Expert 12.0 軟件對表2數據進行處理,得到回歸模型方程:Y=33.062+1.06A+0.34B+0.49C-0.0009AB+0.0011AC+0.0021BC-0.0097A2-0.0057B2-0.0062C2。

方差分析結果見表3。

表3 方差分析結果

由表3可知,模型的P=0.0001<0.01,失擬項P=0.6860>0.05,表明該模型極顯著,擬合程度好。此外,一次項A、B,二次項A2、B2、C2對響應值的影響極顯著,說明這些因素對響應值的影響很大。由于F值與影響強度呈正相關[14],根據F值可知,各因素對毛菊苣總黃酮和總多酚提取的影響大小順序為:A(乙醇體積分數)>B(超聲時間)>C(料液比)。

2.2.3 響應面分析

各因素交互作用對綜合評分影響的響應面圖及等高線圖如圖4所示。

圖4 各因素交互作用對綜合評分影響的響應面圖及等高線圖Fig.4 Response surface plots and contour plots for effect of interaction between various factors on comprehensive score

響應曲面越陡,等高線越接近橢圓形,說明兩因素的交互作用越顯著。由圖4可知,交互作用強弱順序為BC>AC>AB。最終得到毛菊苣總黃酮和總多酚的最佳提取工藝為:乙醇體積分數56.37%、超聲時間35.82 min、料液比1∶50.61,在此條件下,浸膏得率為16.660%、總黃酮含量為17.067 mg·g-1、總多酚含量為9.248 mg·g-1,綜合評分預測值為14.974。

2.3 最佳工藝驗證

考慮到實際操作的可行性,將毛菊苣總黃酮和總多酚的提取工藝調整為:乙醇體積分數56%、超聲時間35 min、料液比1∶50。在此條件下進行驗證實驗,浸膏得率為16.333%、總黃酮含量為17.977 mg·g-1、總多酚含量為9.150 mg·g-1,綜合評分為14.998,與預測值(14.974)接近,其相對誤差為0.16%。

3 結論

在單因素實驗的基礎上,采用響應面法結合熵權法優化了毛菊苣總黃酮和總多酚的超聲提取工藝。結果表明,乙醇體積分數對綜合評分的影響最大,是毛菊苣總黃酮和總多酚提取工藝優化的關鍵因素。最佳提取工藝為:乙醇體積分數56%、超聲時間35 min、料液比1∶50(g∶mL),在此條件下,浸膏得率為16.333%、總黃酮含量為17.977 mg·g-1、總多酚含量為9.150 mg·g-1,綜合評分為14.998。與秦冬梅[8]的研究結果(浸膏得率為5.255%±0.052%,總黃酮得率為0.849%±0.027%)相比,浸膏得率提高3倍多,總黃酮得率提高2倍多。此外,發現在相同提取條件下,總黃酮含量約為總多酚含量的2倍。該研究為今后毛菊苣總黃酮和總多酚的提取及活性研究提供了依據。