響應面法優化酶解-超聲雙輔助雙水相體系制備五味子提取物

宋皓瑜,張彬鋒,MAENG Yoo Jae

(樂金生活健康化妝品研發(上海)有限公司,上海 200233)

五味子是木蘭科植物五味子[Schisandrachinensis(Turcz.) Baill.]的干燥成熟果實,廣泛分布于我國東北部、韓國以及日本,具有止咳、鎮靜、保肝的功效。目前,已從五味子中分離鑒定出202種化合物,其中木脂素類有86種,是五味子的主要化學組分及重要藥理活性成分[1]。五味子乙素是一種聯苯環辛烯木脂素,具有保護肝臟[2]、抑制UVB導致的自由基累積、緩解Propionibacteriumacnes引發的痤瘡相關炎癥、減少細胞及胚胎中黑色素合成等功效[3-5],常被作為功效成分添加在化妝品中[6]。

雙水相體系是一種液-液分離技術,利用不同大分子在互不相溶的兩個液相間分配系數的較大差異進行分離。雙水相體系兩相的主要成分為水且反應條件溫和,不僅有利于維持化合物結構和性質的穩定,也展現出環保、低成本、易于放大生產等優勢[7]。目前關于五味子的研究多集中在利用雙水相體系結合超聲技術提取五味子活性成分,而前處理過程與雙水相體系相結合的研究較少。酶法具有高效、環保、易操作等特點,是有效的前處理手段,可與雙水相體系相結合。鑒于此,作者采用酶解-超聲雙輔助乙醇/硫酸銨雙水相體系制備五味子提取物,在單因素實驗的基礎上,采用響應面法優化制備工藝,并通過比較雙水相體系、酶輔助雙水相體系、超聲輔助雙水相體系及酶解-超聲雙輔助雙水相體系等方法對五味子乙素的提取效果,驗證前處理對雙水相體系的積極作用,擬為五味子在化妝品領域的應用提供理論基礎。

1 實驗

1.1 材料、試劑與儀器

五味子(批號2433910),購于遼寧,經鑒定為木蘭科植物五味子[Schisandrachinensis(Turcz.) Baill.]的干燥成熟果實。粉碎后置于陰涼干燥處,備用。

五味子乙素標準品(批號RDD-W00101910028,純度>98%),成都瑞思芬德丹生物科技有限公司;纖維素酶(10 000 U·g-1);乙腈,色譜純;無水乙醇、硫酸銨、甲醇,分析純。

Agilent 1260 Infinity Ⅱ型高效液相色譜儀,美國Agilent公司;0406-1型臺式離心機,上海醫療器械(集團)有限公司手術器械廠;UC-22.5H型加熱超聲波清洗器,上海泰坦科技股份有限公司;JP-300C型高速多功能粉碎機,永康久品工貿有限公司;HWS26型電熱恒溫水浴鍋,上海一恒科學儀器有限公司;S220-K型pH計,上海亞津電子科技有限公司;RC7型磁力攪拌機,上海久然儀器設備有限公司;ME104型電子天平,瑞士梅特勒-托利多集團。

1.2 酶解-超聲雙輔助雙水相體系制備五味子提取物

精密稱取一定量的五味子粉末于具塞錐形瓶中,加入3%(以五味子質量計)纖維素酶及一定量的水,調節pH值至5.0,于40 ℃水浴3 h后再沸水浴10 min;冷卻至室溫,加入一定量的無水乙醇及硫酸銨,置于超聲波清洗器中,于35 ℃、500 W處理一定時間;反應液于4 000 r·min-1離心10 min,分別記錄上相、下相體積,收集上相。

1.3 五味子乙素得率的測定

1.3.1 五味子乙素對照溶液的配制

稱取5.4 mg五味子乙素標準品,用甲醇溶解并定容至5 mL,搖勻,即得1.08 mg·mL-1五味子乙素對照溶液。

1.3.2 供試溶液的制備

精密吸取1.25 mL上相于5 mL容量瓶中,用50%乙醇定容至刻度,搖勻,經0.45 μm濾膜過濾,即得供試溶液。

1.3.3 色譜條件

Poroshell HPH-C18色譜柱(3 mm×100 mm,2.7 μm);流動相為乙腈(A)-水(B),梯度洗脫程序:0～5 min,35%～40%A;5～20 min,40%～45%A;20～25 min,45%～55%A;25～32 min,55%～75%A;32～37 min,75%～35%A;37～40 min,35%A;二極管陣列檢測器(DAD),檢測波長225 nm;流速1 mL·min-1;柱溫37 ℃;進樣量2 μL。

1.3.4 標準曲線的繪制

移取一定體積的1.08 mg·mL-1五味子乙素對照溶液,用甲醇稀釋至濃度分別為400 μg·mL-1、320 μg·mL-1、240 μg·mL-1、160 μg·mL-1、80 μg·mL-1、40 μg·mL-1,按1.3.3色譜條件進樣分析;以五味子乙素濃度(x)為橫坐標、峰面積(y)為縱坐標繪制標準曲線,擬合得線性回歸方程為:y= 11.284x-86.437,R2=0.9995,表明五味子乙素濃度在40～400 μg·mL-1范圍內與峰面積線性關系良好。

1.3.5 五味子乙素得率及相比的計算

取供試溶液,按1.3.3色譜條件進樣分析,分別按式(1)、(2)計算五味子乙素得率及相比:

(1)

(2)

式中:c為供試溶液中五味子乙素濃度,μg·mL-1;V1為上相體積,mL;n為稀釋倍數;m為五味子粉末質量,g;V2為下相體積,mL。

1.4 五味子提取物制備工藝的優化

采用單因素實驗,分別考察乙醇體積分數(15%、20%、25%、30%、35%)、硫酸銨質量分數(20%、22%、24%、26%、28%)、超聲時間(30 min、45 min、60 min、75 min、90 min)及液固比(10∶1、20∶1、30∶1、40∶1、50∶1,mL∶g,下同)對五味子乙素得率及相比的影響。

在單因素實驗的基礎上,使用Design-Expert 8.0.6軟件設計4因素3水平響應面實驗,以五味子乙素得率為響應值,進一步對五味子提取物制備工藝進行優化。

1.5 數據統計與分析

每組實驗做3個平行,數據以平均值±標準偏差表示。使用SPSS軟件進行數據顯著性分析,使用Origin軟件繪圖。

2 結果與討論

2.1 HPLC圖譜

五味子乙素對照溶液及供試溶液的HPLC圖譜如圖1所示。

圖1 五味子乙素對照溶液(a)及供試溶液(b)的HPLC圖譜Fig.1 HPLC spectra of schisandrin B control solution(a) and sample solution(b)

2.2 單因素實驗結果

2.2.1 乙醇體積分數對五味子乙素得率及相比的影響(圖2)

反應條件:硫酸銨質量分數26%、液固比20∶1、超聲時間60 min

由圖2可知,隨著乙醇體積分數的增加,五味子乙素得率及相比均逐漸升高;當乙醇體積分數從15%增至35%時,五味子乙素得率從0.94 mg·g-1升至1.98 mg·g-1。這是因為,隨著乙醇體積分數的增加,上相體積增加,且其中乙醇含量增加,有利于富集醇溶性的五味子乙素[8]。但得率并非評價雙水相體系功效的唯一參數,合適的相比同樣重要。在制備五味子提取物時,相比過高不利于兩相分離,其維持在0.7～1.2對成分富集及實驗操作更為有利[9]。當乙醇體積分數為25%時,相比為0.84,處于合理范圍內,此時五味子乙素得率與乙醇體積分數為30%時的得率無顯著性差異(P>0.05)。因此,綜合考慮五味子乙素得率、提取成本及實驗可操作性,選取25%作為響應面實驗乙醇體積分數的中心點。

2.2.2 硫酸銨質量分數對五味子乙素得率及相比的影響(圖3)

反應條件:乙醇體積分數25%、液固比20∶1、超聲時間60 min

由圖3可知,隨著硫酸銨質量分數的增加,五味子乙素得率先升高后保持不變,相比則逐漸下降;當硫酸銨質量分數為26%時,五味子乙素得率達到最高,為1.71 mg·g-1,此時相比為0.84,處于合理范圍內。這是因為,增加硫酸銨質量分數會促進水分子在下相的聚集,使上相中乙醇含量增加,促進五味子乙素在上相聚集[10];當硫酸銨飽和后,繼續增加其質量分數不會對體系產生影響[11]。綜合考慮五味子乙素得率及提取成本,選取26%作為響應面實驗硫酸銨質量分數的中心點。

2.2.3 超聲時間對五味子乙素得率及相比的影響(圖4)

反應條件:乙醇體積分數25%、硫酸銨質量分數26%、液固比20∶1

由圖4可知,隨著超聲時間的延長,五味子乙素得率先升高后降低,相比先穩定不變后下降;當超聲時間為45 min時,五味子乙素得率達到最高,為1.72 mg·g-1,此時相比為0.83,處于合理范圍內。這是因為,超聲波可破碎五味子細胞壁,加速成分溶出[12];同時促進雙水相體系中上、下兩相的分相過程,使溶出的五味子乙素在乙醇中充分富集,因此在超聲處理前期五味子乙素得率升高[13];在較高超聲頻率下,超聲時間過長會使五味子乙素得率降低,與Corbin等[14]的研究結果相吻合,可能是由于超聲導致五味子乙素的降解及異構化[15]。綜合考慮,選取45 min作為響應面實驗超聲時間的中心點。

2.2.4 液固比對五味子乙素得率及相比的影響(圖5)

反應條件:乙醇體積分數25%、硫酸銨質量分數26%、超聲時間45 min

由圖5可知,隨著液固比的增大,五味子乙素得率先升高后降低,相比逐漸升高;當液固比為30∶1時,五味子乙素得率達到最高,為1.73 mg·g-1,此時相比為0.84,處于合理范圍內。這是因為,足量的溶劑可使五味子粉末充分溶脹,從而促進溶劑滲入細胞內部,細胞內有效成分擴散至細胞外[16],且溶劑與五味子粉末的充分接觸可強化超聲能量傳遞效率,促進有效成分溶出[17];但是液固比過大時,過多的溶劑吸收了超聲能量,使得作用于五味子粉末的能量相對降低,導致五味子乙素得率下降[18],且會耗費大量的乙醇與硫酸銨。綜合考慮,選取30∶1作為響應面實驗液固比的中心點。

2.3 響應面實驗結果

2.3.1 響應面實驗設計與結果

響應面實驗的因素與水平見表1,設計與結果見表2。

表1 響應面實驗的因素與水平

表2 響應面實驗設計與結果

使用Design-Expert 8.0.6軟件對表2數據進行擬合,得到二次多項回歸模型方程為:Y=1.74+0.048A+0.027B+0.018C+0.027D-0.048AB-0.002500AC-0.040AD-0.013BC+0.020BD+0.010CD-0.048A2-0.023B2-0.013C2-0.065D2。

2.3.2 方差分析

對回歸模型進行方差分析和顯著性檢驗,結果見表3。

表3 方差分析

2.3.3 響應面分析

各因素交互作用對五味子乙素得率影響的響應面圖及等高線圖如圖6所示。

圖6 各因素交互作用對五味子乙素得率影響的響應面圖及等高線圖Fig.6 Response surface plots and contour plots for effects of interaction between various factors on yield of schisandrin B

響應曲面越陡峭、等高線近似橢圓形說明兩因素交互作用對五味子乙素得率的影響較大;反之則說明影響較小。圖6a和圖6c的響應曲面對角走勢陡峭,等高線變化范圍大,且近似橢圓形,說明乙醇體積分數與硫酸銨質量分數的交互作用、乙醇體積分數與液固比的交互作用對五味子乙素得率的影響顯著,與方差分析結果相吻合。

2.3.4 最佳工藝的確定及驗證

通過Design-Expert軟件分析,酶解-超聲雙輔助雙水相體系制備五味子提取物的最佳條件為:乙醇體積分數27.45%、硫酸銨質量分數25.82%、超聲時間56.30 min、液固比30.98∶1 ,此時五味子乙素的理論得率為1.76 mg·g-1。

考慮到實際操作可行性,將超聲時間調整為56 min,其它條件不變,進行3次平行驗證實驗,五味子乙素平均得率為1.77 mg·g-1,相對標準偏差為0.82%,說明模型擬合準確,所得最佳工藝穩定、可行。

2.4 多種制備方法的比較

在確定的最佳條件下,分別采用雙水相體系、酶輔助雙水相體系、超聲輔助雙水相體系及酶解-超聲雙輔助雙水相體系制備五味子提取物,五味子乙素得率(mg·g-1)大小依次為:酶解-超聲雙輔助雙水相體系(1.7600±0.0045)>超聲輔助雙水相體系(1.6300±0.0197)>酶輔助雙水相體系(1.6200±0.0117)>雙水相體系(1.5300±0.0174)。這是因為,纖維素酶作用于纖維素β-D-葡萄糖苷鍵,催化植物細胞壁中纖維素降解,促進有效物質釋放[19];超聲波削弱五味子細胞壁強度[12],同時加速雙水相體系的分相過程,使五味子粉末位于上、下兩相中間,形成液-固-液的萃取體系,促進五味子乙素在上相的富集[13];酶解-超聲雙輔助雙水相體系同時具備酶解、超聲、雙水相提取的協同作用,可有效提高五味子乙素得率[20]。

3 結論

在單因素實驗的基礎上,以五味子乙素得率為響應值,采用響應面法優化了酶解-超聲雙輔助雙水相體系制備五味子提取物的工藝條件,確定最佳條件為:乙醇體積分數27.45%、硫酸銨質量分數25.82%、超聲時間56 min、液固比30.98∶1(mL∶g),在此條件下,五味子乙素得率為1.77 mg·g-1,與模型預測值(1.76 mg·g-1)接近。酶解-超聲雙輔助雙水相體系制備的五味子乙素得率顯著高于雙水相體系、酶輔助雙水相體系及超聲輔助雙水相體系,說明前處理可有效促進雙水相體系對五味子乙素的富集。該研究建立的酶解-超聲雙輔助雙水相體系易操作、成本低,是制備五味子提取物的有效方式。