改變培養條件下藻棲棘孢木霉cf44-2中的沒藥烷類倍半萜衍生物的分離純化與鑒定

于汶莉,宋銀平,季乃云

(1.中國科學院煙臺海岸帶研究所,山東 煙臺 264003;2.中國科學院大學,北京 100049)

木霉屬真菌種類及次級代謝產物具有多樣性、復雜性和豐富性特點,已從木霉屬真菌中分離、鑒定了許多結構新穎的次級代謝產物,包括萜類、聚酮類、甾體類、生物堿類、肽類等[1-2],其中萜類化合物含量較豐富[3]。近年來,一些結構骨架獨特、取代類型新穎的萜類化合物陸續在海洋木霉中被發現[4-5],這些新的萜類化合物具有多種生物活性,如抗菌活性、細胞毒活性以及對海洋浮游生物的抑制活性等[4-7]。

海洋來源的棘孢木霉(Trichodermaasperellum)是已知次級代謝產物較為豐富的真菌,已鑒定出新化合物90多個,結構類型涵蓋倍半萜、二萜、甾體、聚酮、生物堿和肽類[8-16]。棘孢木霉cf44-2是從舟山群島褐藻門馬尾藻屬海藻(Sargassumsp.)的內部組織中分離得到的1株內生真菌,此前對其次級代謝產物研究時得到了包括甾體類衍生物(tricholumin A)、環橙花烷類倍半萜(9-cycloneren-3,7,11-triol、11-cycloneren-3,7,10-triol、7,10-epoxycycloneran-3,11,12-triol)、沒藥烷類倍半萜(trichaspin、trichaspside A、trichaspside B、bisabolan-1,10,11-triol、12-nor-11-acetoxybisabolen-3,6,7-triol)等新化合物[13-15],但從該菌株中發現的沒藥烷類倍半萜的數量少于其它同種菌株。為深入挖掘海洋藻棲棘孢木霉cf44-2中倍半萜類化合物的化學多樣性,作者通過改變培養條件,獲得一系列結構多樣的沒藥烷類倍半萜衍生物,并對其結構進行鑒定。

1 實驗

1.1 材料、試劑與儀器

GF-254硅膠板、硅膠填料(100～200目、200～300目),青島海洋化工廠;Sephadex LH-20填料,GE公司;RP-18填料,YMC公司。

除色譜級甲醇和色譜級乙腈外,其余均為分析純有機試劑,上海國藥集團化學試劑有限公司。

Bruker AVANCE Ⅲ 500型超導核磁共振波譜儀(1HNMR為500 MHz,13CNMR為125 MHz);Agilent 1260型高效液相色譜系統(Eclipese SB-C18色譜柱,9.4 mm×250 mm,5 μm)。

1.2 菌株與培養基

棘孢木霉cf44-2,自舟山群島近岸采集的褐藻門馬尾藻屬海藻(Sargassumsp.)的內生絲狀真菌,鑒定信息參見文獻[15],菌株序列已提交Genbank數據庫(序列號:MG696741),現保藏于中國典型培養物保藏中心(CCTCC:M 2017360)。

大米固體培養基:1 L培養瓶中加入大米20 g、蒸餾水20 mL、陳海水20 mL、蛋白胨0.6 g。

1.3 方法

1.3.1 菌株培養

選用大米固體培養基培養菌株cf44-2,共培養200瓶(1 L),在25 ℃下靜態培養40 d。

1.3.2 發酵產物的分離純化

菌株cf44-2靜態培養40 d后,加入200 mL乙酸乙酯,浸泡48 h;抽濾,將菌絲體與液體分開;液體用乙酸乙酯反復萃取3次后,有機相減壓濃縮,即得發酵液粗提物;菌絲體自然風干,粉碎后用二氯甲烷-甲醇(1∶1,體積比)浸泡提取,共提取3次,抽濾,有機相減壓濃縮,即得菌絲體粗提物;合并發酵液粗提物和菌絲體粗提物,即得總粗提物。

將總粗提物進行硅膠柱層析,收集各組分;再經反相硅膠柱層析、Sephadex LH-20凝膠柱層析、硅膠柱層析、制備薄層層析(TLC檢測用254 nm和365 nm暗箱三用紫外燈觀察,或采用硫酸-茴香醛顯色劑加熱顯色)、半制備高效液相色譜等方法分離純化。

1.3.3 純化產物的結構鑒定

通過1HNMR、13CNMR分析并比對文獻數據,對純化產物的結構進行鑒定。

2 結果與討論

2.1 結構鑒定

從棘孢木霉cf44-2發酵產物中獲得8個沒藥烷類倍半萜衍生物,其結構式如圖1所示。

圖1 8個沒藥烷類倍半萜衍生物的結構式Fig.1 Structural formulas of eight bisabolane sesquiterpene derivatives

化合物1:無色油狀。1HNMR(500 MHz,CDCl3),δ:5.61(1H,dt,J=0.2 Hz、1.5 Hz,H-2),5.52(1H,dt,J=10.1 Hz、1.1 Hz,H-1),5.10(1H,t,J=7.1 Hz,H-10),1.69(3H,s,H-13),1.60(3H,s,H-12),1.28(3H,t,J=2.8 Hz,H-15),0.85(3H,dd,J=12.2 Hz、6.8 Hz,H-14)。13CNMR(125 MHz,CDCl3),δ:134.7(C-2,CH),132.3(C-1,CH),131.5(C-11,C),124.8(C-10,CH),70.0(C-3,C),40.3(C-6,CH),38.5(C-4,CH2),36.4(C-7,CH),34.3(C-8,CH2),28.5(C-15,CH3),26.1(C-9,CH2),25.9(C-13,CH3),22.5(C-5,CH2),17.8(C-12,CH3),15.9(C-14,CH3)。通過比對,化合物1的1HNMR、13CNMR數據與文獻[17]報道化合物(3S*,6R*,7S*)-zingiberenol的數據一致。此前對棘孢木霉cf44-2的次級代謝產物研究中,同樣分離得到化合物1。

化合物2:無色油狀。1HNMR(500 MHz,CDCl3),δ:5.85(1H,m,H-2),5.10(1H,tm,J=7.0 Hz,H-10),2.15(1H,dt,J=12.5 Hz、4.2 Hz,H-6),1.93(3H,m,H-15),1.67(3H,s,H-13),1.59(3H,s,H-12),1.29(2H,m,H-8),0.79(3H,d,J=6.8 Hz,H-14)。13CNMR(125 MHz,CDCl3),δ:201.3(C-1,C),161.4(C-3,C),131.6(C-11,C),127.3(C-2,CH),124.6(C-10,CH),50.0(C-6,CH),34.8(C-8,CH2),31.0(C-4,CH2),30.4(C-7,CH),26.1(C-9,CH2),25.9(C-9,CH2),24.3(C-13,CH3),22.5(C-5,CH),17.8(C-12,CH3),15.7(C-14,CH3)。通過比對,化合物2的1HNMR、13CNMR數據與文獻[18]報道化合物(6R*,7S*)-2,10-bisaboladien-1-one的數據一致。

化合物3:無色油狀。1HNMR(500 MHz,CDCl3),δ:5.87(1H,s,H-2),3.54(1H,dd,J=10.3 Hz、2.5 Hz,H-10),2.15(1H,dt,J=13.1 Hz、3.9 Hz,H-6),1.95(3H,s,H-15),1.21(3H,s,H-13),1.15(3H,s,H-12),0.95(3H,d,J=6.7 Hz,H-14)。13CNMR(125 MHz,CDCl3),δ:202.3(C-1,C),162.6(C-3,C),127.2(C-2,CH),76.6(C-10,CH),73.0(C-11,C),51.8(C-6,CH),31.4(C-4,CH2),28.6(C-9,CH2),28.4(C-7,CH),28.2(C-8,CH2),26.7(C-13,CH3),24.3(C-15,CH3),23.4(C-12,CH2),22.6(C-5,CH2),17.2(C-14,CH3)。通過比對,化合物3的1HNMR、13CNMR數據與文獻[19]報道化合物trichodone A的數據一致。

化合物4～8:均為無色油狀。通過1HNMR、13CNMR數據分析并結合文獻數據,發現與trichobisabolin Z(4)、trichobisabolin Q(5)、trichobisabolin N(6)、trichobisabolin S(7)、trichobisabolin M(8)數據一致,相關波譜數據見文獻[20-21]。

2.2 討論

棘孢木霉是海洋木霉屬真菌中的重要一員。目前,涉及次級代謝產物的海洋來源棘孢木霉至少有6株(dl-34、Y6-2、A-YMD-9-2、cf44-2、Y19-07或17以及1株未編號的棘孢木霉),其中有4株為藻棲棘孢木霉。已報道的海洋來源棘孢木霉次級代謝產物具有高度的新穎性和多樣性,包括倍半萜及其衍生物、二萜、聚酮、多肽等。其中倍半萜及其衍生物占絕大多數且種類豐富,包括21個沒藥烷類倍半萜、24個環橙花烷類倍半萜、2個杜松烷類倍半萜等[4,8-16,22-24]。Song等[9-12]在研究藻棲棘孢木霉A-YMD-9-2的次級代謝產物時,以大米為基質對菌株進行培養,發現了7個新的沒藥烷類倍半萜、16個新的環橙花烷類倍半萜及4個已知的環橙花烷類倍半萜。

藻棲棘孢木霉cf44-2在此前的研究中以馬鈴薯為基質進行發酵培養,得到了包括1個甾體類衍生物、3個環橙花烷類倍半萜、5個沒藥烷類倍半萜在內的新化合物[13-15],其中沒藥烷類倍半萜相較于其它同種菌株的數量較少。眾所周知,培養條件不同對真菌次級代謝產物具有顯著影響[25-26]?；诖?Shi等[16]以土豆為基質對棘孢木霉Y6-2進行培養,發現了8個新的沒藥烷類衍生物。本研究通過改變培養條件,選用大米固體培養基對棘孢木霉cf44-2進行培養,除同樣獲得化合物1外,新代謝產生了7個新的沒藥烷類倍半萜衍生物,其中含5個降沒藥烷倍半萜。由此可以推測,以大米為基質對棘孢木霉cf44-2進行培養,在一定程度上可以增加其次級代謝產物中沒藥烷類倍半萜的數量及結構多樣性;不同棘孢木霉的代謝產物類型受菌株自身代謝以及培養條件的影響。

本研究首次發現藻棲棘孢木霉cf44-2為產化合物1和2的木霉菌株,而此前該類化合物是在研究蝽蟲(Halyomorphahalys)信息素時獲得的[17-18]。trichodone A(3)則是在藥用植物三七(Panaxnotoginseng)的內生棘孢木霉中首次被發現[19],可見化合物3存在于不同來源的棘孢木霉中。本研究獲得的8個沒藥烷類倍半萜衍生物中,包含5個降沒藥烷倍半萜,化合物4為在C11位連氧的降倍半萜,化合物5～8均為含吡喃環降倍半萜,化合物4～8在不同種類的海洋藻棲木霉中均有發現[19-20]。據文獻報道,化合物4、5和7對4種海洋浮游植物(Amphidiniumcarterae、Chattonellamarina、Heterosigmaakashiwo、Prorocentrumdonghaiense)均有抑制作用,IC50值為0.54～8.4 μg·mL-1,部分化合物對檸檬假交替單胞菌(Pseudoalteromonascitrea)及某些海洋弧菌具有抑制作用[20]。化合物6和8也具有一定抗菌活性,但對海洋浮游植物的抑制活性較弱[21]。

3 結論

在前期研究的基礎上,進一步探究了海洋藻棲棘孢木霉cf44-2中倍半萜類化合物的化學多樣性,以改變培養條件的方式,對其次級代謝產物進行研究。發現改變培養條件誘導菌株cf44-2產生了7個新的沒藥烷類倍半萜衍生物,其中部分化合物具有一定的生物活性。表明,改變培養條件是使棘孢木霉中萜類代謝產物多樣化的有效途徑,為今后進一步深入挖掘棘孢木霉次級代謝產物提供了依據。