響應面法優化泡盛曲霉產抗腫瘤活性物質發酵工藝

許 麗,劉 欣

(江蘇省腫瘤醫院 江蘇省腫瘤防治研究所 南京醫科大學附屬腫瘤醫院,江蘇 南京 210009)

喜樹(CamptothecaacuminateDecne.)是我國特有的藥用植物,系珙桐科(Nyssaceae)喜樹屬(CamptothecaDecne.)植物[1]。自1966年Wall等從喜樹莖中分離提取出具有抗腫瘤活性的喜樹堿(camptothecin,CPT)[2]以來,至今已從喜樹中分離得到喜樹堿類物質27種左右,其中喜樹堿和10-羥基喜樹堿(10-hydroxyamptothecin,HCPT)的抗腫瘤活性較強,尤其是HCPT[2-3]。研究[4]表明,喜樹堿是迄今發現的唯一抑制拓撲異構酶Ⅰ(topoisomerase Ⅰ,Topo Ⅰ)的天然植物活性成分,阻礙染色體復制進而造成細胞凋亡。喜樹堿是一種廣譜抗癌藥物,廣泛用于卵巢癌、宮頸癌、結腸癌、慢性粒細胞性白血病等的治療,被稱為“第三大植物抗癌藥”[5]。目前,喜樹堿、HCPT及其衍生物的合成方法主要包括化學合成[6]、組織培養[7]、分離提取[8]等。

為了保護藥用植物,避免過度開采,從藥用植物中分離篩選能合成與藥用植物相同或相似次級代謝產物的內生菌逐漸成為研究熱點[9-11]。陳毅堅等[12]從紅豆杉枝條中分離出52株內生真菌,發現其中19株可發酵產紫杉醇;張玲琪等[13]從藥用植物長春花中分離篩選出1株尖孢鐮刀菌,發現該菌在適宜條件下可發酵產抗腫瘤活性物質長春新堿;李俊峰等[14]在鐵皮石斛植株體內分離篩選出內生菌TG2,發現其次級代謝產物具有明顯抗腫瘤作用,且抗腫瘤活性與次級代謝產物的量成正比;作者所在研究團隊從喜樹中分離篩選出1株HCPT高產內生真菌——泡盛曲霉CS24(AspergillusawamoriCS24),HCPT產量可達到94.6 mg·L-1。為進一步提高泡盛曲霉CS24發酵產HCPT的能力,作者在此對發酵培養基及發酵工藝進行優化,以期為規模化發酵生產抗腫瘤活性物質提供幫助。

1 實驗

1.1 材料、試劑與儀器

泡盛曲霉CS24,從喜樹(CamptothecaacuminateDecne.)果實中分離篩選,具有較強的發酵產HCPT能力及體外抗腫瘤活性,經形態學觀察、顯微鏡檢及ITS測序分析,鑒定其為泡盛曲霉(Aspergillusawamori),保存于江蘇省腫瘤防治研究所;人胃癌細胞BGC-823,上海聯邁生物工程有限公司;酵母浸膏、瓊脂、蔗糖、可溶性淀粉、麥芽浸膏、胰蛋白胨,山東浩中化工科技有限公司;馬鈴薯,市售。

10-羥基喜樹堿(HCPT)標準品,上海一基生物試劑有限公司;甲醇、乙腈,色譜純,西亞化學科技(山東)有限公司;CCK-8試劑盒,上海炎熙生物科技有限公司;CaCl2、K2HPO4、NaCl、KH2PO4、KNO3、Na2HPO4、MgSO4·7H2O、葡萄糖,分析純,無錫亞泰聯合化工有限公司。

11-LC-20AT型高效液相色譜儀,日本島津公司;HZ-124/85S型電子分析天平,廣州璟騏儀器有限公司;UV-1600型紫外可見分光光度計,山東安耐自動化儀表有限公司;TGL27A型高速冷凍離心機,上海五相儀器儀表有限公司;XFH-30CA型高壓蒸汽滅菌鍋,紹興景邁儀器設備有限公司;BBS-SDC型超凈工作臺,濟南歐萊博科學儀器有限公司;HS系列-250(F)型恒溫恒濕培養箱,青島聚創環保集團有限公司;JSZZ10L型發酵罐,江蘇中正生物工程設備有限公司。

1.2 培養基

PDA培養基:馬鈴薯200.0 g·L-1(去皮,切成1 cm3小塊),葡萄糖20.0 g·L-1,瓊脂 17.0 g·L-1,雙蒸水1 000 mL,pH值自然,121 ℃滅菌20 min。

PDB培養基:馬鈴薯200.0 g·L-1(去皮,切成1 cm3小塊),葡萄糖20.0 g·L-1,雙蒸水1 000 mL,pH值自然,121 ℃滅菌20 min。

1.3 泡盛曲霉CS24發酵產HCPT的工藝條件優化

選擇PDB培養基,以泡盛曲霉CS24為發酵菌種,在初始pH值為5.0、發酵溫度為29 ℃、攪拌轉速為380 r·min-1、通風量為0.6 vvm、發酵時間為6 d的條件下發酵培養。

以HCPT產量為考核指標,通過單因素實驗分別考察初始pH值、發酵溫度、攪拌轉速、通風量、氮源、碳源、無機鹽離子等對泡盛曲霉CS24發酵產HCPT的影響,每組實驗做3個平行;在單因素實驗的基礎上,以HCPT產量為響應值,選取初始pH值、發酵溫度、攪拌轉速、通風量、花生餅粉含量、玉米漿干粉含量、蔗糖含量、糊精含量、麥芽糖含量、Mg2+含量等10個因素進行Plackett-Burman實驗[15-17]、最陡爬坡實驗[18]、Box-Behnken響應面實驗,對泡盛曲霉CS24發酵產HCPT的工藝條件進行優化。

1.4 菌體生物量和HCPT產量的測定

泡盛曲霉CS24菌體生物量的測定:取泡盛曲霉CS24發酵液10 mL,于4 ℃、5 000 r·min-1離心15 min,棄上清液,得到泡盛曲霉CS24菌體,用電子分析天平稱重,即為菌體生物量。

泡盛曲霉CS24發酵液中HCPT產量的測定:采用高效液相色譜法測定[19]。

1.5 數據處理

使用OriginPro 8.0軟件對實驗數據進行分析處理[20],使用Design-Expert Ⅴ13.0.5.0軟件進行響應面實驗設計和分析[21-24]。

2 結果與討論

2.1 單因素實驗結果

2.1.1 初始pH值對泡盛曲霉CS24發酵產HCPT的影響

其它條件保持不變,調節初始pH值發酵6 d,測定菌體生物量和HCPT產量,結果如圖1所示。

圖1 初始pH值對泡盛曲霉CS24發酵產HCPT的影響Fig.1 Effect of initial pH value on production of HCPT by Aspergillus awamori CS24

由圖1可知,隨著初始pH值的增大,泡盛曲霉CS24菌體生物量和HCPT產量均先升高后降低;在初始pH值為5.0時,菌體生物量和HCPT產量均達到最高,分別為139.9 g·L-1和89.9 mg·L-1。因此,初始pH值選擇5.0。

2.1.2 發酵溫度對泡盛曲霉CS24發酵產HCPT的影響

將處于對數生長期成熟的泡盛曲霉CS24接種于發酵罐中,其它條件保持不變,調節發酵溫度發酵6 d,測定菌體生物量和HCPT產量,結果如圖2所示。

圖2 發酵溫度對泡盛曲霉CS24發酵產HCPT的影響Fig.2 Effect of fermentation temperature on production of HCPT by Aspergillus awamori CS24

由圖2可知,隨著發酵溫度的升高,泡盛曲霉CS24菌體生物量和HCPT產量均先升高后降低;在發酵溫度為28.5～29.5 ℃時,菌體生物量達到最高,為136.2 g·L-1;在發酵溫度為29.0 ℃時,HCPT產量達到最高,為89.7 mg·L-1。因此,發酵溫度選擇29.0 ℃。

2.1.3 攪拌轉速對泡盛曲霉CS24發酵產HCPT的影響

發酵過程開動攪拌有利于物質的傳遞以及增加溶氧。將處于對數生長期成熟的泡盛曲霉CS24接種于發酵罐中,其它條件保持不變,調節攪拌轉速發酵6 d,測定菌體生物量和HCPT產量,結果如圖3所示。

圖3 攪拌轉速對泡盛曲霉CS24發酵產HCPT的影響Fig.3 Effect of stirring speed on production of HCPT by Aspergillus awamori CS24

由圖3可知,隨著攪拌轉速的加快,泡盛曲霉CS24菌體生物量和HCPT產量均緩慢升高而后迅速降低;在攪拌轉速為380 r·min-1時,菌體生物量和HCPT產量均達到最高,分別為141.4 g·L-1和94.7 mg·L-1。這可能是因為,攪拌轉速過快形成的較大剪切力損傷了泡盛曲霉CS24的菌絲,抑制了菌體生長和產物合成。因此,攪拌轉速選擇380 r·min-1。

2.1.4 通風量對泡盛曲霉CS24發酵產HCPT的影響

發酵過程中向發酵罐中通入無菌空氣,主要是為發酵菌種提供氧氣,氧氣含量是發酵過程中重要的限制因素;泡盛曲霉CS24是好氧菌,發酵過程需要一定量的氧氣。將處于對數生長期成熟的泡盛曲霉CS24接種于發酵罐中,其它條件保持不變,調節通風量發酵6 d,測定菌體生物量和HCPT產量,結果如圖4所示。

圖4 通風量對泡盛曲霉CS24發酵產HCPT的影響Fig.4 Effect of ventilation rate on production of HCPT by Aspergillus awamori CS24

由圖4可知,隨著通風量的增加,泡盛曲霉CS24菌體生物量和HCPT產量均先升高后降低;在通風量為0.6 vvm時,菌體生物量和HCPT產量均達到最高,

分別為146.8 g·L-1和92.6 mg·L-1。因此,通風量選擇0.6 vvm。

2.1.5 氮源對泡盛曲霉CS24發酵產HCPT的影響

分別以黃豆餅粉、花生餅粉、棉籽餅粉、玉米漿干粉、酵母浸粉、酪蛋白、尿素、硫酸銨和硝酸鉀作為培養基氮源,含量為10 g·L-1,發酵6 d,測定菌體生物量和HCPT產量,結果如圖5所示。

圖5 氮源對泡盛曲霉CS24發酵產HCPT的影響Fig.5 Effect of nitrogen source on production of HCPT byAspergillus awamori CS24

由圖5可知,氮源對泡盛曲霉CS24菌體生物量和HCPT產量影響顯著。以花生餅粉、玉米漿干粉、酪蛋白作為氮源時,菌體生物量和HCPT產量均較高,分別為117.6 g·L-1、137.8 g·L-1、123.6 g·L-1和73.8 mg·L-1、79.4 mg·L-1、69.8 mg·L-1;以玉米漿干粉作為氮源時,菌體生物量和HCPT產量均達到最高。綜合考慮原材料成本,選擇花生餅粉和玉米漿干粉作為培養基氮源。

2.1.6 碳源對泡盛曲霉CS24發酵產HCPT的影響

分別以可溶性淀粉、玉米粉、燕麥粉、糊精、麥芽糖、蔗糖、乳糖、葡萄糖和山梨醇作為培養基碳源,含量為30 g·L-1,發酵6 d,測定菌體生物量和HCPT產量,結果如圖6所示。

圖6 碳源對泡盛曲霉CS24發酵產HCPT的影響Fig.6 Effect of carbon source on production of HCPT by Aspergillus awamori CS24

由圖6可知,碳源對泡盛曲霉CS24菌體生物量和HCPT產量影響較大。以麥芽糖、蔗糖、葡萄糖作為碳源時,菌體生物量較高,分別為134.6 g·L-1、143.7 g·L-1、139.7 g·L-1;以糊精、麥芽糖、蔗糖作為碳源時,HCPT產量較高,分別為83.6 mg·L-1、88.9 mg·L-1、94.3 mg·L-1;以蔗糖作為碳源時,菌體生物量和HCPT產量均達到最高。綜合考慮原材料成本,選擇蔗糖、糊精和麥芽糖作為培養基碳源。

2.1.7 無機鹽離子對泡盛曲霉CS24發酵產HCPT的影響

圖7 無機鹽離子對泡盛曲霉CS24發酵產HCPT的影響Fig.7 Effect of inorganic salt ion on production of HCPT by Aspergillus awamori CS24

由圖7可知,無機鹽離子對泡盛曲霉CS24菌體生物量和HCPT產量影響顯著。Ca2+嚴重抑制了泡盛曲霉CS24的生長繁殖,菌體生物量僅22.6 g·L-1;Cu2+嚴重抑制了HCPT的合成,HCPT產量僅12.4 mg·L-1;Mg2+對泡盛曲霉CS24的生長繁殖和HCPT合成均具有明顯的促進作用,菌體生物量和HCPT產量分別達到了136.6 g·L-1和87.9 mg·L-1。因此,選擇在培養基中添加Mg2+進行后續實驗。

2.2 Plackett-Burman實驗結果

Plackett-Burman實驗的因素與水平見表1,設計與結果見表2,方差分析見表3。

表1 Plackett-Burman實驗的因素與水平

表2 Plackett-Burman實驗設計與結果

表3 Plackett-Burman實驗的方差分析

由表3可知,模型的P值為0.002 4(<0.01),而失擬項的P值為0.478 1(>0.05),說明設計的模型具有統計學意義。從方差來源的各個因素來看,發酵溫度、通風量、玉米漿干粉含量等3個因素對HCPT產量影響極顯著(P<0.01);初始pH值、攪拌轉速、花生餅粉含量、蔗糖含量、糊精含量、麥芽糖含量、Mg2+含量等7個因素對HCPT產量影響不顯著(P>0.05)。同時根據各因素的預估系數可以看出,發酵溫度和通風量對HCPT產量的影響表現出負效應,而玉米漿干粉含量表現出正效應。

2.3 最陡爬坡實驗結果

在Plackett-Burman實驗的基礎上,篩選出3個顯著影響泡盛曲霉CS24發酵產HCPT的因素:發酵溫度、通風量、玉米漿干粉含量,根據實際情況設計每個因素的步長和爬坡方向,進行最陡爬坡實驗以確定中心組合設計的水平中心。最陡爬坡實驗設計與結果見表4。

表4 最陡爬坡實驗設計與結果

由表4可知,第2組實驗的HCPT產量最高,達到94.6 mg·L-1。所以,以第2組實驗的條件(發酵溫度29 ℃、通風量0.6 vvm、玉米漿干粉含量12 g·L-1)作為中心組合設計的水平中心。

2.4 響應面實驗結果

2.4.1 Box-Behnken實驗

綜合Plackett-Burman實驗及最陡爬坡實驗結果,以發酵溫度29 ℃、通風量0.6 vvm、玉米漿干粉含量12 g·L-1為中心點,以HCPT產量為響應值,進行Box-Behnken實驗,實驗設計與結果見表5,方差分析見表6。

表5 Box-Behnken實驗設計與結果

表6 Box-Behnken實驗的方差分析

對表5數據進行擬合,得到回歸模型:Y=21.27000-0.79842A+1.67342B+1.83245C-1.53984AB+1.45783AC-0.75467BC-8.97654A2-5.78345B2-2.49887C2。

2.4.2 響應面分析

泡盛曲霉CS24發酵產HCPT過程中各因素交互作用對HCPT產量影響的響應面圖及等高線圖如圖8所示。

圖8 各因素交互作用對HCPT產量影響的響應面圖及等高線圖Fig.8 Response surface plots and contour plots for effects of interaction between various factors on HCPT yield

由圖8a可知,當發酵溫度一定時,HCPT產量隨著通風量的增加呈現出先升高后降低的趨勢;同時,當通風量一定時,HCPT產量隨著發酵溫度的升高也呈現出先升高后降低的趨勢;二者的等高線呈明顯的橢圓形,表明發酵溫度與通風量的交互作用對HCPT產量影響極顯著。由圖8b可知,發酵溫度與玉米漿干粉含量的曲面都有一定的弧度,并且發酵溫度的曲面弧度大于玉米漿干粉含量的,表明發酵溫度對HCPT產量的影響大于玉米漿干粉含量;二者的等高線呈明顯的橢圓形,但不如發酵溫度與通風量的交互作用,表明發酵溫度與玉米漿干粉含量的交互作用對HCPT產量影響不顯著。由圖8c可知,通風量與玉米漿干粉含量的交互作用對HCPT產量影響的響應面圖及等高線圖與圖8b相似,表明通風量與玉米漿干粉含量的交互作用對HCPT產量影響不顯著。綜上,各因素對HCPT產量的影響大小順序為:發酵溫度>通風量>玉米漿干粉含量,與Box-Behnken實驗的方差分析結果一致。

運用軟件Design-Expert V 13.0.5.0對回歸方程求解,得到泡盛曲霉CS24發酵產HCPT的最優工藝條件為:發酵溫度29 ℃、通風量0.6 vvm、攪拌轉速380 r·min-1、初始pH值5.0、玉米漿干粉含量13 g·L-1、花生餅粉含量25 g·L-1、蔗糖含量10 g·L-1、糊精含量30 g·L-1、麥芽糖含量15 g·L-1、Mg2+含量0.5 mmol·L-1。

2.5 驗證實驗

對回歸方程預測的最優發酵工藝條件進行3次平行驗證實驗, HCPT產量平均值為171.6 mg·L-1(SD=0.0024),比優化前(94.6 mg·L-1)提高了44.9%,比現有文獻[25]報道的HCPT產量高出238.6%,與預測值吻合度較高,表明構建的模型可靠,可用于預測泡盛曲霉CS24發酵產HCPT的實際生產。

3 結論

利用泡盛曲霉CS24發酵產HCPT。通過單因素實驗和Plackett-Burman實驗,篩選出發酵溫度、通風量和玉米漿干粉含量等3個影響發酵的顯著因素;然后通過最陡爬坡實驗確定中心組合設計的水平中心;最后通過Box-Behnken實驗、響應面分析獲得最優培養基為:玉米漿干粉13 g·L-1、花生餅粉25 g·L-1、蔗糖10 g·L-1、糊精30 g·L-1、麥芽糖15 g·L-1、Mg2+0.5 mmol·L-1;最優發酵工藝為:發酵溫度29 ℃、通風量0.6 vvm、攪拌轉速380 r·min-1、初始pH值5.0。在此條件下,HCPT產量達到了171.6 mg·L-1,比優化前(94.6 mg·L-1)提高了44.9%。該研究為工業化發酵生產HCPT奠定了理論和實踐基礎。