超聲波輔助醇提法提取銀杏葉中多種活性成分

李濟甫,馮揚帆,孟珂渏,王沈燕,劉 鑫,馬 燕,楊 潔,2*

(1.武漢東湖學院護理與健康管理學院(生命科學與化學學院),湖北 武漢 430212;2.武漢東湖學院生物醫用材料創新研究所,湖北 武漢 430212)

銀杏是我國的特有藥用植物,其根、莖、葉、花、果實、樹皮均可入藥,尤其是銀杏葉,易于采摘,又具有極高藥用價值,常作為主要入藥采集部位。銀杏葉中含有多種生物活性成分,如黃酮類、萜內酯類、多糖類、有機酸、有機醇等[1]。我國每年作為植物藥原料使用的銀杏葉達數萬噸,大部分用于生產口服制劑用銀杏葉提取物,這些未做單一成分分離的銀杏葉提取物在應用中受到了很大限制,多種活性成分由于含量低或其它成分的影響而未發揮應有的藥理作用。近年來,研究人員為分離出高純度的銀杏葉活性成分進行了深入探索,成功分離得到高純度的黃酮醇苷、萜內酯等活性成分[2],但多集中于單一活性成分。目前,具有抗禽流感病毒、抗菌、抗癌等藥理學功能的莽草酸以及具有增強免疫力、抗腫瘤、抗病毒、抗凝血作用的多糖已被初步分離與富集,且數量巨大[3-4],若能分階段分離純化,進行綜合開發利用,可有效提升銀杏產業的附加值,還可減少對環境的污染。

常用的銀杏葉活性成分提取方法有有機溶劑提取法、水提法、水提-樹脂法、微波輔助提取法、超聲波輔助提取法、酶解提取法等[5-6],提取方法對各活性成分的產率和產品質量影響很大。作者采用超聲波輔助醇提法綜合提取銀杏葉中多種活性成分,通過溶劑萃取法脫脂、去葉綠素,經DM130大孔樹脂吸附脫附后,再對銀杏多糖、銀杏莽草酸、銀杏黃酮分階段逐一分離純化,并對工藝條件進行優化,為銀杏葉多種活性成分的綜合開發利用奠定基礎。

1 實驗

1.1 材料、試劑與儀器

銀杏葉,6年齡,采摘于武漢東湖學院校內。

DM130型大孔吸附樹脂(弱極性),天津浩聚樹脂科技有限公司;莽草酸標準品,上海阿拉丁生化科技股份有限公司;蘆丁標準品,上海源葉生物科技有限公司;葡萄糖標準品,國藥集團有限公司;其它試劑均為分析純。

LC-16型高效液相色譜儀、AUY120型分析天平,日本島津公司;721型紫外可見分光光度計,上海菁華科技儀器有限公司;FW100型高速粉碎機,天津泰斯特儀器有限公司;KQ-100DE型超聲波清洗器,昆山超聲儀器有限公司;RE-52AA型旋轉蒸發儀,上海亞榮生化儀器廠。

1.2 方法

1.2.1 銀杏葉提取物的制備

將銀杏葉洗凈,烘干,粉碎,過60目篩,備用。稱取10 g銀杏葉粉,按料液比1∶5(g∶mL,下同)加入75%乙醇,40 ℃下200 W超聲提取2 h;過濾,濾渣再超聲提取2次;合并濾液,減壓回收乙醇,得棕色銀杏葉提取物。

1.2.2 銀杏葉提取物的脫脂處理

將銀杏葉提取物加水溶解,用1/3倍體積的石油醚萃取2～3次以脫脂、去葉綠素,取下層分液進行分離純化。

1.2.3 銀杏葉提取物的分離純化

將分液濃縮后加至大孔吸附樹脂柱上,控制流速為1 BV·h-1,使完全吸附;然后用2～3 BV純水洗脫,洗脫速度為2 BV·h-1;再用2～3 BV的75%乙醇洗脫;洗脫液濃縮至原體積一半,用稀鹽酸調節pH值為3.2,加入2倍體積75%乙醇沉淀;6 000 r·min-1離心10 min,分出沉淀,上清液再醇沉2次;合并沉淀,得銀杏多糖粗提物;按料液比1∶5(g∶mL)加入0.2%H2O2溶液,進行脫色處理;依次用無水乙醇、丙酮、乙醚洗滌各2次,減壓濃縮,低溫干燥,得銀杏多糖成品。

將銀杏葉提取物洗脫液醇沉3次后的上清液減壓濃縮除醇后,加入2倍體積的石油醚,攪拌4 h,倒入分液漏斗靜置分液;將上層液濃縮至原體積一半后再用2倍體積石油醚沉淀2次;合并沉淀,得銀杏莽草酸粗提物;加入少量石油醚,攪拌,分出莽草酸固液混合相,過濾,洗滌,低溫干燥,得銀杏莽草酸成品。

將銀杏葉提取物洗脫液減壓濃縮除醇后,用飽和Ca(OH)2溶液調節pH值為8,4 ℃下靜置,過濾去除堿性不溶物;用6 mol·L-1鹽酸調節pH值為3～4,4 ℃下靜置,過濾去除酸性不溶物;濾液濃縮干燥,得銀杏黃酮成品。

2 結果與討論

2.1 綜合提取工藝優化

2.1.1 乙醇體積分數對各活性成分產率的影響(圖1)

圖1 乙醇體積分數對銀杏多糖、銀杏莽草酸、銀杏黃酮產率的影響Fig.1 Effect of ethanol volume fraction on yields of ginkgo polysaccharides,ginkgo shikimic acid,and ginkgo flavonoids

由圖1可知,當乙醇體積分數從45%增至75%時,銀杏多糖、銀杏莽草酸、銀杏黃酮的產率均增幅明顯;當乙醇體積分數超過75%后,產率均趨于穩定。這是因為,銀杏多糖、銀杏莽草酸、銀杏黃酮都易溶于醇水溶液,隨著乙醇體積分數的增加,提取量增加,產率相應升高[7];在提取達到平衡后,繼續增加乙醇體積分數,會增加分離負荷,浪費試劑,增加生產成本。因此,確定最佳乙醇體積分數為75%。

2.1.2 超聲時間對各活性成分產率的影響(圖2)

由圖2可知,隨著超聲時間的延長,銀杏多糖、銀杏莽草酸、銀杏黃酮的產率均逐漸升高而后略微降低;在超聲時間為2.0 h時,三者產率均達到最高。可能是因為,超聲時間過長,溶出物在持續高頻率超聲波的作用下會部分降解而失去生物活性,導致產率略微降低[7]。綜合考慮,確定最佳超聲時間為2.0 h。

2.1.3 脫脂溶劑對各活性成分產率的影響

未脫脂的銀杏葉粗提物含有大量的脂類、葉綠素等物質,給活性成分的分離純化帶來困難,不僅耗時而且成本高[8]。在分離純化前脫脂,一方面可以縮短分離時間,減少提取溶劑的用量;另一方面,脫脂后更有利于分離,提高活性成分的產率,純度也會得到很大提升。分別以石油醚、乙醚對銀杏葉粗提物進行脫脂處理,考察脫脂溶劑對各活性成分產率的影響,結果見表1。

表1 脫脂溶劑對銀杏多糖、銀杏莽草酸、銀杏黃酮產率的影響/%

由表1可知,以石油醚和乙醚為脫脂溶劑時,各活性成分產率明顯高于未脫脂時的,其中石油醚的脫脂效果最佳。可能是因為,石油醚和乙醚都有脫脂作用,但是乙醚一般要與乙醇或甲醇等比例混合時脫脂效果才較好,又因各活性成分均易溶于乙醇,且乙醚沸點低,易揮發,故單純乙醚的脫脂效果略差于石油醚。因此,確定最佳脫脂溶劑為石油醚。

2.2 分離純化工藝優化

2.2.1 銀杏多糖脫色劑的選擇

常用的脫色方法有離子交換法、活性炭法和H2O2法,離子交換法脫色過程復雜,操作繁瑣。本實驗分別采用活性炭法和H2O2法對銀杏多糖粗提物進行脫色,其脫色效果見表2。

表2 活性炭法和H2O2法的脫色效果比較

由表2可知,隨著活性炭用量的增加,銀杏多糖的脫色效果越來越好,但產率顯著降低,可能是因為,活性炭疏松多孔,在吸附色素雜質的同時,銀杏多糖(多為酸性多糖大分子極性化合物)易被活性炭吸附而導致產率降低;相較于活性炭脫色,H2O2的脫色效果較理想,但用量不能過多,否則易導致多糖降解,一般在0.4%以內較佳,且脫色過程中多糖幾乎無損失,同時H2O2具有揮發性,脫色后容易除去。綜合考慮,采用0.2%H2O2對銀杏多糖進行脫色。

2.2.2 銀杏莽草酸的分離純化方法選擇

莽草酸的分離多采用樹脂吸附法和柱層析法。鑒于銀杏葉提取物洗脫液在醇沉3次后已除去大部分雜質,本研究采用有機溶劑沉淀法分離純化銀杏莽草酸。考慮到莽草酸難溶于石油醚,在石油醚中可沉淀析出[9],又由于石油醚的密度小,與莽草酸形成的固液混合相產生分層,可以采用分液漏斗分離;再將含有莽草酸沉淀的固液混合相過濾,洗滌,得到高純度莽草酸。該法大大降低了分離難度,經過兩次沉淀分離,銀杏莽草酸的純度可達98%以上,與樹脂吸附法的分離效果相當,而且方法更簡便。因此,采用石油醚沉淀法對銀杏莽草酸進行分離純化。

2.2.3 銀杏黃酮的分離純化方法選擇

銀杏葉提取物洗脫液減壓濃縮除醇后,可能還有少量多糖等黏性雜質。采用酸堿除雜法對銀杏黃酮進行分離純化,通過加入飽和Ca(OH)2溶液使堿性沉淀析出,再調節pH值至3～4除去酸性雜質,純度最高可達35.72%。

2.3 綜合提取與單獨提取的比較

在優化的工藝條件下,采用超聲波輔助醇提法綜合提取銀杏多糖、銀杏莽草酸、銀杏黃酮;另取相同量的銀杏葉粉,在相同條件下采用超聲波輔助醇提法分別提取銀杏多糖、銀杏莽草酸、銀杏黃酮,提取結果見表3。

表3 綜合提取與單獨提取結果比較

由表3可知,在優化工藝條件下,采用超聲波輔助醇提法綜合提取銀杏葉中多種活性成分,銀杏多糖、銀杏莽草酸、銀杏黃酮的產率分別為4.67%、3.80%、0.77%;而采用超聲波輔助醇提法分別提取銀杏葉中銀杏多糖、銀杏莽草酸、銀杏黃酮,其產率分別為4.88%、3.91%、0.83%。從產率來看,雖然每種活性成分的綜合提取產率較單獨提取的略低,但綜合提取的總產率要遠遠高于任意單獨提取的;從產品質量來看,綜合提取和單獨提取的活性成分的產品純度相差不大,外觀幾乎無差別。與單獨提取比較,綜合提取的成本低、資源利用度高,具有更高的產業化價值。

3 結論

采用超聲波輔助醇提法綜合提取銀杏多糖、銀杏莽草酸、銀杏黃酮,通過溶劑萃取法脫脂、去葉綠素,DM130大孔樹脂吸附脫附,再逐一分離純化,得到高純度的銀杏多糖、銀杏莽草酸、銀杏黃酮,其純度分別為85.20%、98.25%、35.72%,產率分別為4.67%、3.80%、0.77%。該方法使銀杏葉得到了最大化利用,為銀杏葉的進一步開發利用提供了參考。