正交實驗優化重樓皂苷Ⅰ的微波提取工藝

張雪嬌,王 月,范 濤,成 昭

(西安醫學院藥學院,陜西 西安 710021)

重樓是一種傳統中藥材,通常以根莖入藥,具有消腫止痛、涼肝定驚等功效,常用于治療蛇蟲咬傷、跌撲傷痛、疔瘡癰腫等癥。藥理學研究發現,重樓的主要活性成分甾體皂苷具有抗菌消炎、鎮痛止血及抗腫瘤等藥理活性[1],其中重樓皂苷Ⅰ的抗腫瘤活性已成為研究熱點。鄧碧凡等[2]通過MTT法檢測發現,重樓皂苷Ⅰ對低氧條件下的喉癌Hep-2細胞增殖具有明顯的抑制作用;陳舒怡等[3]研究發現,重樓皂苷Ⅰ可通過線粒體破碎快速誘導肺癌NCI-H661細胞的凋亡;龐曉輝等[4]研究發現,結腸癌耐奧沙利鉑細胞經重樓皂苷Ⅰ處理后,其Bax和Caspass-3蛋白表達水平有所升高,進而介導癌細胞及其耐藥細胞的凋亡。

重樓皂苷Ⅰ的提取一般采用有機溶劑回流法,以乙醇為提取溶劑,易操作、成本低,但提取率較低[5-6]。童立雷等[7]利用纖維素酶對植物細胞壁的破碎作用,以70%乙醇為提取溶劑,采用超聲輔助酶法提取重樓總皂苷,并通過響應面法優化提取工藝;劉江等[8]采用正交實驗優化了南重樓中4種重樓皂苷的超聲提取工藝,并對優化工藝進行了方法學考察。近年來,微波法越來越多地應用于中藥活性成分的提取[9-10]。因此,作者采用微波法提取重樓皂苷Ⅰ,并通過正交實驗優化提取工藝,為重樓藥材的深入開發利用提供參考。

1 實驗

1.1 材料、試劑與儀器

重樓,采自陜西漢中鎮巴山區,經西安醫學院藥學院生藥教研室張彥副教授鑒定為百合科重樓屬植物的干燥根莖。

重樓皂苷Ⅰ對照品(>98%),優級純,寶雞辰光生物科技有限公司;95%乙醇、無水甲醇,分析純,天津歐博凱化工有限公司;甲醇、乙腈,優級純,天津科密歐化學試劑有限公司;實驗用水為去離子水。

Agilent 1260型高效液相色譜儀(C18色譜柱,250 mm×4.6 mm),美國Agilent科技有限公司;XH-300A型電腦微波超聲波組合合成萃取儀,北京祥鵠科技發展有限公司;ALC-210.4型電子天平,北京賽多利斯科技儀器有限公司;微孔濾膜(0.45 μm),天津杉羽科技有限公司;SHZ-D(Ⅲ)型循環水式真空泵,鞏義予華儀器有限責任公司。

1.2 重樓皂苷Ⅰ的提取

重樓自然晾干,50 ℃烘至恒重,粉碎過篩,得粗粉,置于干燥器儲存備用。稱取1.00 g重樓粗粉置于50 mL潔凈干燥的三頸燒瓶中,加入一定量的乙醇,在萃取儀中提取一定時間,冷卻至室溫,抽濾,濾液用乙醇定容至50 mL容量瓶中,即得重樓皂苷Ⅰ提取液。

1.3 重樓皂苷Ⅰ的微波提取工藝優化

采用單因素實驗,分別考察乙醇體積分數、微波功率、微波溫度、微波時間和料液比對重樓皂苷Ⅰ提取率的影響。

在單因素實驗的基礎上,固定微波功率為300 W,選擇乙醇體積分數(A)、微波溫度(B)、微波時間(C)和料液比(D)為考察因素,以重樓皂苷Ⅰ提取率為評價指標,設計4因素3水平正交實驗,進一步優化重樓皂苷Ⅰ的微波提取工藝。

1.4 重樓皂苷Ⅰ提取率的測定

1.4.1 色譜條件

Agilent C18色譜柱;流動相為乙腈-水(30∶70,體積比);檢測波長203 nm;體積流量1 mL·min-1;柱溫30 ℃。

1.4.2 重樓皂苷Ⅰ標準曲線的繪制

精密稱取重樓皂苷Ⅰ對照品2.0 mg,用甲醇溶解后定容于5 mL容量瓶中,搖勻,得濃度為0.40 mg·mL-1的重樓皂苷Ⅰ對照溶液。分別準確吸取4 μL、8 μL、12 μL、16 μL、20 μL重樓皂苷Ⅰ對照溶液,按1.4.1色譜條件進樣分析,記錄峰面積,以重樓皂苷Ⅰ含量(x,μg)為橫坐標、峰面積(y)為縱坐標繪制標準曲線(圖1),擬合得線性回歸方程:y=437.88x+39.4,R2=0.9965。表明重樓皂苷Ⅰ含量在 1.60～8.00 μg范圍內與峰面積線性關系良好。

圖1 重樓皂苷Ⅰ的標準曲線Fig.1 Standard curve of polyphyllin Ⅰ

1.4.3 重樓皂苷Ⅰ提取率的計算

移取適量重樓皂苷Ⅰ提取液,經0.45 μm微孔濾膜過濾;準確吸取10 μL,按1.4.1色譜條件進樣分析,記錄峰面積,根據標準曲線方程計算重樓皂苷Ⅰ含量,按下式計算重樓皂苷Ⅰ提取率(η):

式中:m為重樓皂苷Ⅰ的質量,μg;V為重樓皂苷Ⅰ提取液體積,mL;m粉為重樓粗粉的質量,g。

2 結果與討論

2.1 HPLC圖譜

準確吸取10 μL重樓皂苷Ⅰ對照溶液,按1.4.1色譜條件進樣分析,HPLC圖譜如圖2所示。

圖2 重樓皂苷Ⅰ對照溶液的HPLC圖譜Fig.2 HPLC spectrum of polyphyllin Ⅰ control solution

2.2 單因素實驗結果

2.2.1 乙醇體積分數的選擇

固定微波功率250 W、微波溫度60 ℃、微波時間30 min、料液比1∶20(g∶mL,下同),考察乙醇體積分數(45%、55%、65%、75%、95%)對重樓皂苷Ⅰ提取率的影響,結果如圖3所示。

圖3 乙醇體積分數對重樓皂苷Ⅰ提取率的影響Fig.3 Effect of ethanol volume fraction on extraction rate of polyphyllin Ⅰ

由圖3可知,隨著乙醇體積分數的增加,重樓皂苷Ⅰ提取率先升高后降低;當乙醇體積分數為55%時,提取率達到最高。可能是因為,乙醇體積分數較大時,重樓粗粉中其它成分的溶出量增加,導致提取率降低。

因此,選擇45%、55%、65%作為正交實驗乙醇體積分數的3個水平。

2.2.2 微波功率的選擇

固定乙醇體積分數55%、微波溫度60 ℃、微波時間30 min、料液比1∶20,考察微波功率(150 W、200 W、250 W、300 W、350 W)對重樓皂苷Ⅰ提取率的影響,結果如圖4所示。

圖4 微波功率對重樓皂苷Ⅰ提取率的影響Fig.4 Effect of microwave power on extraction rate of polyphyllin Ⅰ

由圖4可知,隨著微波功率的增大,重樓皂苷Ⅰ提取率先升高后降低;當微波功率為300 W時,提取率達到最高。可能是因為,增大微波功率加速了對細胞壁的破碎作用,提高了活性成分的溶出率,提取率相應升高;但微波功率過大時,會引起植物組織內部的微小導管因凝固而閉塞[11],使活性成分的溶出受到抑制,導致提取率降低。當微波功率從250 W增至300 W時,提取率變化不明顯,但微波功率較大時更有利于活性成分的溶出。因此,選擇最佳微波功率為300 W。

2.2.3 微波溫度的選擇

固定乙醇體積分數55%、微波功率300 W、微波時間30 min、料液比1∶20,考察微波溫度(40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃、80 ℃)對重樓皂苷Ⅰ提取率的影響,結果如圖5所示。

圖5 微波溫度對重樓皂苷Ⅰ提取率的影響Fig.5 Effect of microwave temperature on extraction rate of polyphyllin Ⅰ

由圖5可知,隨著微波溫度的升高,重樓皂苷Ⅰ提取率先升高后降低;當微波溫度為70 ℃時,提取率達到最高。這是因為,升高溫度有利于提取溶劑對活性成分的溶解和擴散;但溫度過高時,不但會影響活性成分的穩定性,而且會使重樓粗粉中其它成分的溶出量增加。因此,選擇60 ℃、70 ℃、80 ℃作為正交實驗微波溫度的3個水平。

2.2.4 微波時間的選擇

固定乙醇體積分數55%、微波功率300 W、微波溫度60 ℃、料液比1∶20,考察微波時間(15 min、20 min、25 min、30 min、35 min)對重樓皂苷Ⅰ提取率的影響,結果如圖6所示。

圖6 微波時間對重樓皂苷Ⅰ提取率的影響Fig.6 Effect of microwave time on extraction rate of polyphyllin Ⅰ

由圖6可知,隨著微波時間的延長,重樓皂苷Ⅰ提取率先升高后略微降低;當微波時間為30 min時,提取率達到最高。這是因為,延長微波時間有利于植物細胞的破碎,進而有利于活性成分的溶出;但微波時間過長時,其它成分的溶出量也增多。因此,選擇25 min、30 min、35 min作為正交實驗微波時間的3個水平。

2.2.5 料液比的選擇

固定乙醇體積分數55%、微波功率300 W、微波溫度60 ℃、微波時間30 min,考察料液比(1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25)對重樓皂苷Ⅰ提取率的影響,結果如圖7所示。

圖7 料液比對重樓皂苷Ⅰ提取率的影響Fig.7 Effect of solid-liquid ratio on extraction rate of polyphyllinⅠ

由圖7可知,隨著料液比的減小,即溶劑用量的增加,重樓皂苷Ⅰ提取率先升高后降低;當料液比為1∶15 時,提取率達到最高。這是因為,當溶劑用量增加時,活性成分擴散到溶劑中的機會增多,提取率相應升高。因此,選擇1∶10 、1∶15 、1∶20作為正交實驗料液比的3個水平。

2.3 正交實驗結果

正交實驗結果與分析見表1,方差分析見表2。

表1 正交實驗結果與分析

表2 方差分析

由表1、表2可知,各因素對重樓皂苷Ⅰ提取率影響的大小順序為:微波溫度(B)>乙醇體積分數(A)>料液比(D)>微波時間(C)。微波溫度和乙醇體積分數對重樓皂苷Ⅰ提取率的影響顯著,而料液比和微波時間的影響不顯著。最佳提取工藝組合為A1B3C3D2,即乙醇體積分數45%、微波溫度80 ℃、微波時間35 min、料液比1∶15。

2.4 工藝驗證

在上述最佳工藝條件下進行3次驗證實驗,重樓皂苷Ⅰ提取率分別為5.46%、5.39%、5.58%,平均提取率為5.47%,相對標準偏差(RSD)為1.75%,說明實驗結果可靠。

3 結論

通過HPLC法測定重樓皂苷Ⅰ含量,以重樓皂苷Ⅰ提取率為評價指標,采用單因素實驗結合正交實驗優化了重樓中活性成分重樓皂苷Ⅰ的微波提取工藝。確定最佳提取工藝為:乙醇體積分數45%、微波功率300 W、微波溫度80 ℃、微波時間35 min、料液比1∶15(g∶mL),在此條件下,重樓皂苷Ⅰ提取率達到5.47%。該方法操作簡單、省時、高效,可用于重樓皂苷Ⅰ的提取。