乙型肝炎病毒共價閉合環狀DNA 清除的研究進展

李成，莫雪，牛文霞，李明明，付麗娟，，3

1.湖北省孝感市中心醫院，湖北孝感 432000；2.廈門大學附屬翔安醫院感染科，福建廈門 361000；3.廈門市感染性疾病質量控制中心，福建廈門 361000

慢性乙型肝炎是乙型肝炎病毒持續感染引起的以肝臟慢性炎癥性改變為主要特征的一類傳染病。長期慢性感染會導致肝纖維化、肝硬化、肝癌等終末期肝病的發生，嚴重危害人民群眾的健康。慢性乙型肝炎病毒感染依然是全球公共衛生健康問題之一。據世界衛生組織統計，全球約有20 億人曾經感染過HBV，近2.57 億人為慢性感染者，其中每年約78 萬人死于HBV 相關肝病及其并發癥，嚴重威脅人類健康[1]。接種乙肝疫苗是預防乙肝病毒感染最有效的途徑。乙肝疫苗在我國廣泛接種使得新發感染率逐年下降，我國現在屬于HBV 中度流行區的國家，目前我國有7 400 萬人為HBV 攜帶者[2]。

當前臨床上使用的抗乙肝病毒治療藥物主要為聚乙二醇化干擾素α（polyethylene glycol interferon, PEG-IFNα）和核苷（酸）類似物[nucleos(t)ide analogues, NAs][3]。雖然這兩類藥物均能有效抑制HBV 復制，阻止炎癥進展和改善預后。但兩者都不能影響最初形成的共價閉合環狀DNA（covalently closed circular DNA, cccDNA），同時對感染肝細胞核內現存的cccDNA 沒有清除作用，也不能對整合到肝細胞染色體上的病毒基因起到清除作用。因此，患者往往需要長期使用抗乙肝病毒藥物治療來抑制病毒復制。目前臨床上使用的抗病毒治療方案都無法徹底地清除感染肝細胞核內cccDNA，難以實現慢性乙型肝炎的完全治愈[4]。為了達到徹底治愈HBV 感染的目標，關鍵在于可以靶向根除感染肝細胞核內cccDNA 的抗病毒治療策略[5]。本文對HBV cccDNA 清除的研究進展進行綜述，旨在尋找徹底清除cccDNA 的方法。

1 靶向抑制cccDNA 的形成

感染肝細胞核內的cccDNA 是HBV 感染肝細胞后由雙鏈環狀不完全閉合DNA（relaxed circular DNA, rcDNA）在核內利用細胞的DNA 損傷修復機制轉化形成的。病毒以cccDNA 為模板轉錄合成所有的RNA 和子代病毒基因組。具有超螺旋結構的cccDNA 與細胞組蛋白、非組蛋白等結合形成微染色體穩定存在于被感染肝細胞核內，加之目前缺乏直接靶向cccDNA 的抗病毒治療藥物，使得HBV 能長期存在于乙肝患者肝臟內并導致慢性感染。因此，研究HBV cccDNA 的形成機制和HBV 與宿主相互作用對于研發清除cccDNA 藥物、治愈慢性乙型肝炎具有重大意義。

研究表明進入肝細胞核內的rcDNA 轉化形成cccDNA 的過程至少包括負鏈5’端病毒聚合酶、負鏈5’端和3’端的冗余片段、正鏈5’端的RNA 引物的去除和正鏈3’端缺口及雙鏈間隙的填補[6]。在此過程中，酪氨酰-DNA-磷酸二酯酶2（tyrosyl-DNA-phosphodiesterase 2, TDP2）[7]參與去除rcDNA負鏈5’端共價連接病毒聚合酶的過程，促進rcDNA向cccDNA 的轉化。然而，在另一項研究中發現TDP2 并不是體內cccDNA 形成過程中不可或缺的宿主DNA 修復酶[8]。Flap 核酸內切酶1（flap endonuclease 1, FEN1）[9]結合并切割rcDNA 負鏈5’端的冗余片段促使rcDNA 向cccDNA 的轉化。DNA 聚合酶κ、α、DNA 連接酶（DNA ligases, LIG）參與cccDNA形成過程中DNA 缺口的修復[10-12]，其中細胞內cccDNA 擴增需要DNA 聚合酶α、δ 和ε 的參與，HBV從頭感染過程中需要DNA 聚合酶κ 和λ 的參與。此外，研究發現DNA 拓撲異構酶、共濟失調毛細血管擴張與RAD3 相關（ataxia telangiectasia and RAD3-related, ATR）途徑也參與了cccDNA 形成過程中rcDNA 的損傷修復[13-14]。

最近一項由rcDNA 底物經過酵母和人肝癌細胞提取物及純化人蛋白修復形成cccDNA 的實驗篩選確定了rcDNA 修復形成cccDNA 過程中的5 個關鍵宿主因子：增殖細胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen, PCNA）、復制因子C 復合物（replication factor C complex, RFC）、POLδ、FEN1 和LIG1[15]。rcDNA 向cccDNA 轉化過程中正鏈和負鏈缺口修復所需要的宿主因子不完全相同[16]，其中正鏈缺口修復需要PCNA、RFC、POLδ、FEN1 和LIG1 這5 個宿主因子的參與，而負鏈的修復只需要FEN1 和LIG1 的參與。這對于全面了解rcDNA 是如何轉化形成cccDNA 的過程及研發新的靶向藥物至關重要。

脫蛋白的松弛環狀DNA（deproteinized relaxed circular DNA, DP-rcDNA）是rcDNA 轉變形成cccDNA 過程中重要中間產物。通過HBeAg 的比例表達來監測cccDNA 水平的細胞篩選策略研究發現兩種結構相關的雙取代磺酰胺（disubstituted sulfonamides, DSS）（CCC-0975 和CCC-0346），DSS 化合物通過降低HepDES19 細胞中DP-rcDNA 的水平抑制rcDNA 向cccDNA 的轉化來減少cccDNA 的生物合成[17]。DSS 化合物有望成為臨床治療HBV 的新型藥物。一項對包含大約1 000 個參與DNA 損傷反應、表觀遺傳和核酸結合途徑的基因文庫進行siRNA 篩選研究確定了剪接體成分前mRNA 加工因子31（pre-mRNA processing factor 31, PRPF31）參與cccDNA 的形成[18]。該研究表明PRPF31 與HBx 共定位于細胞核內，只有當PRPF31-HBx 共同過表達時cccDNA 的形成才會顯著增加。PRPF31-HBx 復合物如何促進cccDNA 形成機制有待進一步研究。抑制PRPF31 與HBx 之間的相互作用可以作為抗HBV 治療的新靶點。

2 沉默cccDNA 的轉錄

肝細胞核內的cccDNA 并不都是以簡單的超螺旋結構游離形式存在，部分與組蛋白、非組蛋白等結合形成微染色體結構。因此cccDNA 的轉錄受到微染色體上組蛋白及非組蛋白的化學修飾調控作用的影響，其中包括DNA 甲基化、組蛋白及非編碼RNA 修飾。HBV cccDNA 包含3 個CpG 島，該區域的甲基化狀態可以參與調控HBV 復制和轉錄，這為CpG 甲基化在調節HBV cccDNA 轉錄功能提供了新的見解[19]。此外，組蛋白甲基化、乙酰化等修飾也參與調節cccDNA 的轉錄過程。陳娟等[6]通過篩選并確定了沉默交配類型信息調控2 同源物3（silent mating type information regulation 2 homolog 3, SIRT3）可以通過與組蛋白甲基轉移酶協同作用來限制cccDNA 轉錄所需要的宿主因子而起到沉默cccDNA 轉錄的作用[20]。這為SIRT3 將來被應用于治療慢性乙型肝炎提供了相關的理論依據。Pollicino T[21]等研究表明cccDNA 的轉錄水平受H3 和H4組蛋白乙酰化水平的影響，其乙酰化可以促進cccDNA 的轉錄，反之則抑制cccDNA 的表達。有研究發現組蛋白脫乙酰基酶11（histone deacetylase 11, HDAC11）被招募到cccDNA 中，通過降低與cccDNA 結合的H3 組蛋白賴氨酸H3K9 和H3K27 的乙酰化水平來抑制cccDNA 的轉錄[22]。最近一項研究報道顯示，組蛋白乙酰基轉移酶1（histone acetylbased transferase 1, HAT1）可以促進微染色體的組裝和組蛋白乙酰化修飾，由于HAT1 可以使新合成的組蛋白發生乙酰化修飾，使得新合成的組蛋白上的乙酰化狀態在宿主細胞中核小體的組裝過程中起到重要作用，進一步解釋了cccDNA 調控的分子機制，這為宿主HAT1 信號調節游離病毒基因組復制機制提供了新的思路[23]。新的一項研究發現SIRT7 通過與HBx 相互作用催化與cccDNA 結合的組蛋白H3K122 脫琥珀酰化在表觀遺傳上沉默cccDNA 的轉錄[24]。該項研究將SIRT7 確定為研發抗HBV 感染的新型表觀遺傳治療提供潛在靶點。

除了DNA 甲基化及組蛋白修飾，非組蛋白也可以參與cccDNA 的表達調控。HBx 可以通過與宿主蛋白的相互作用降解維持染色體結構復合物Smc5/6 來消除Smc5/6 對cccDNA 轉錄的抑制作用，從而促進cccDNA 的轉錄[25]。一項在感染HBV 的原代肝細胞研究中發現了一種噻唑類抗感染藥硝唑尼特（nitazoxanide, NTZ）可以有效抑制HBx 和損傷特異性DNA 結合蛋白1（damage specific DNA binding protein 1, DDB1）的相互作用，進而能夠恢復Smc5蛋白表達來沉默cccDNA 的轉錄及相關病毒蛋白的產生[26]。靶向HBV 相關病毒與宿主蛋白之間相互作用的NTZ 可能為治療慢性乙型肝炎提供新的抗病毒方案。另一項研究發現具有先天傳感器來識別和結合細胞核中cccDNA 功能的干擾素誘導蛋白16（interferon-inducible protein 16, IF16）通過靶向作用于cccDNA 上的干擾素刺激反應元件（interferonstimulated response element, ISRE）進而表觀遺傳抑制cccDNA 的轉錄[27]。該項研究表明IF16 可以作為治療HBV 感染的潛在靶點。通過表觀遺傳修飾途徑沉默cccDNA 的轉錄來抑制HBV 的復制，這為抗HBV 藥物的研發提供新的思路。

3 誘導cccDNA 的降解

HBV 慢性感染患者體內的cccDNA 是不斷變化并維持相對平衡。機體可以通過細胞溶解和非細胞溶解兩個途徑來降解部分cccDNA。細胞溶解途徑是通過免疫損傷和細胞凋亡過程使被感染的肝細胞發生溶解破壞，cccDNA 從細胞內釋放出來被巨噬細胞吞噬或與抗體結合形成免疫復合物后被巨噬細胞吞噬，從而清除cccDNA。相反，非細胞溶解途徑是在免疫應答過程中產生的細胞因子（如干擾素、腫瘤壞死因子和白細胞介素等）在不發生細胞溶解的前提條件下清除細胞內的cccDNA。Xia Y等[28]研究表明T 細胞產生的IFNγ 和TNFα 通過誘導cccDNA 脫氨基作用降低肝細胞內cccDNA 的表達水平。另外，有研究發現高劑量IFNα 和淋巴毒素β受體分別誘導胞嘧啶脫氨酶3A 和3B 的表達，通過HBV 核心蛋白與cccDNA 的相互作用，使cccDNA 發生脫氨基作用形成脫嘌呤/脫嘧啶位點，進而降解cccDNA[29]。隨后，Bockmann JH[30]等研究發現與IFNα 相比，IFNβ 和IFNλ 可以更為持久地誘導載脂蛋白B 信使RNA 編輯酶催化多肽樣（apolipoprotein b messenger rna-editing enzyme-catalytic polypeptidelike, APOBEC）脫氨酶的表達，使肝細胞內cccDNA發生脫氨基作用造成G-A 序列的變化來降解cccDNA。

最近研究發現IFN 通過非細胞溶解途徑誘導cccDNA 的降解過程依賴于干擾素刺激基因20（interferon-stimulated Gene 20, ISG20）[31]。ISG20 是促使IFN 誘導cccDNA 降解的核酸酶，這為研發抗HBV 藥物提供潛在靶點。此外，研究還發現轉化生長因子β 在肝細胞中可以通過激活胞苷脫氨酶來誘導cccDNA 脫氨基作用進而降解cccDNA[32]。目前，隨著對細胞因子的研究及PEG-IFNα 在臨床上慢性乙型肝炎表現出的治療效果來看，細胞因子相關藥物的研發將成為臨床上治療HBV 感染新型抗病毒治療方案。然而，有關細胞因子如何通過非細胞溶解途徑來降解cccDNA 機制仍需要深入進行研究。

近年來隨著基因編輯技術的快速發展并在生物醫學研究領域中得到廣泛應用，部分研究學者在構建的體外細胞或動物模型中采用基因編輯技術方法研究cccDNA 降解機制，其中包括鋅指核酸酶（zinc finger nuclease, ZFNs）[33]、轉錄激活因子樣效應物核酸酶（transcription activator like effector nucleases, TALENs）[34]和成簇規律間隔短回文重復序列（clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR）/CRISPR 相關蛋白9（CRISPR/Cas9）技術[35]。但是，由于目前基因編輯技術存在脫靶效應和缺乏相應的體內遞呈載體，使得靶向降解cccDNA 的基因編輯技術在臨床上無法得到有效的應用，需要進行相關研究并找到解決這些問題的對策。

4 結語

HBV 復制周期的復雜性和cccDNA 的穩定性是治療慢性乙型肝炎達到完全治愈的難題。隨著對HBV 在宿主肝細胞內復制周期和cccDNA 形成過程的深入研究，這將為作用在HBV 復制周期各階段潛在靶點的新型抗病毒藥物的研發提供新的思路。因此，應用多途徑的免疫治療聯合多靶點的藥物治療是目前抑制HBV 基因組表達并促使cccDNA 清除的有效抗病毒策略[36]。隨著國內外學者們對HBV與宿主相互作用是如何參與cccDNA 形成確切機制的不斷探索和研究，相信未來一定會實現對cccDNA 的清除和慢性乙型肝炎的治愈。