白楊素通過下調Annexin A3逆轉人肺腺癌A549/DDP細胞順鉑的耐藥性*

劉暉杰, 彭榮, 許華

(1.湖北文理學院附屬襄陽市中心醫院 腫瘤科, 湖北 襄陽 441021; 2.宜城市人民醫院 腫瘤科, 湖北 襄陽 441021; 3.湖北文理學院附屬襄陽市中心醫院 審計處, 湖北 襄陽 441021)

肺癌發病率和死亡率在所有癌癥中居首位,肺腺癌是肺癌的一種,屬于非小細胞癌類型,多發生于女性[1-2]。大多數肺腺癌患者在無法進行手術治療的情況下,均以順鉑藥物(DDP)進行化療治療[3],但患者在長期使用DDP時,會產生耐藥性,使得治療效果顯著降低[4-5],因此,改善和扭轉癌細胞對DDP的耐藥性,是目前臨床研究的重點。膜聯蛋白A3(Annexin A3)與腫瘤的發生、浸潤、轉移、血管形成及耐藥性等功能有密切關系[6],且已發現其在肺腺癌、卵巢癌、胃癌等多種腫瘤細胞中呈較高表達[7]。近來研究發現,有學者已將Annexin A3作為卵巢癌鉑類耐藥的標記蛋白[8],但Annexin A3是否也與肺腺癌鉑類耐藥性有關,目前仍未見報道。白楊素是一種天然黃酮類藥物,具有抗腫瘤、抗炎等作用,其衍生物可抑制人肺腺癌A549細胞生長[9],但其對肺腺癌細胞DDP耐藥性的作用并不清楚。因此本研究通過觀察白楊素對肺腺癌DDP耐藥性細胞A549/DDP對DDP敏感性的影響,并初步探討其機制,以期為臨床治療DDP耐藥型肺癌提供參考。

1 材料與方法

1.1 細胞來源及主要試劑

人肺腺癌細胞A549(CC-Y2130)及人肺腺癌DDP耐藥細胞株A549/DDP(CC-Y1295)購自上海君潤生物,60只C57BL/6小鼠購自西安迪樂普生物醫學有限公司[許可證號SCXK(陜)2019-002],白楊素(CC-Y1294)購自上海酶研生物科技有限公司,10%胎牛血清、胰酶、DMEM培養基購自上海語純生物科技有限公司,Annexin A3 NC、Annexin A3 反轉錄病毒試劑盒購自南京銳真生物技術有限公司,Trizol試劑盒(15596026)、反轉錄試劑盒(4366597)、蛋白提取試劑盒(AM1556)、BCA試劑盒(23227)購自賽默飛世爾中國公司,cDNA 反轉錄試劑盒、PCR檢測試劑盒、PCR 引物序列購自日本TakaRa公司,兔抗人 Annexin A3抗體購自美國 Abcam 公司,兔抗 GAPDH美國 Cell Signaling Technolog,HRP標記的羊抗兔IgG購自中國中杉金橋公司,ECL化學發光劑試劑盒(P0018FA)購自上海碧云天生物技術有限公司。

1.2 研究方法

1.2.1細胞培養及分組 將A549細胞、A549/DDP細胞快速解凍,并離心收集細胞,用含10%胎牛血清的完全培養基懸浮細胞并接種于細胞皿中,置恒溫培箱中進行常規傳代培養并計數。取對數期A549細胞、A549/DDP細胞,以每孔2×105密度種植于6孔板中適應性培養6 h后,用qRT-PCR及Western blot法測膜聯蛋白A3(Annexin A3)基因及蛋白表達。收集對數期A549細胞、A549/DDP細胞,以每孔2×105密度種植于六孔板中,在培養基中分別加入終濃度為0、5、25、50及100 mmoL/L的白楊素干預培養24、48、72 h,用CKK-8法檢測A549細胞、A549/DDP細胞存活情況,篩選出毒性較低(細胞活性>50%)的白楊素濃度,作為實驗時濃度。取A549/DDP細胞,以每孔2×105密度種植于6孔板中,設置為A549/DD組、白楊素組(50 mol/L)、Annexin A3過表達組(Annexin A3mimic組)、Annexin A3陰性對照組(Annexin A3 NC)及白楊素+Annexin A3mimic組;另取A549細胞作為A549組,每組設置6個復孔。A549/DD組選用A549/DD細胞進行干預培養,白楊素組加入終濃度為50 mol/L白楊素,Annexin A3mimic組及Annexin A3 NC組按轉染試劑盒說明書方法轉染Annexin A3mimic及Annexin A3 NC試劑,白楊素+Annexin A3mimic組轉染Annexin A3mimic的同時、加入終濃度為50 mol/L的白楊素進行干預培養。

1.2.2CKK-8檢測 收集各組細胞,加入胰蛋白酶消化,按照CKK-8試劑盒說明書步驟對細胞進行處理,用酶標儀檢測450 nm波長下吸光值,細胞生存率(%)=(藥物處理組吸光值/空白組吸光值)×100%。

1.2.3細胞半數生存濃度(IC50)及耐藥指數檢測 上述細胞加入終濃度為(0、5、15、20、30 mg/L)DDP繼續干預培養24 h,按CKK-8法測細胞在450 nm波長下的吸光值,繪制生存曲線,取細胞生存率為50%時的濃度為IC50,根據公式,耐藥指數=給藥組IC50/空白組IC50,計算各組細胞的耐藥指數。

1.2.4熒光實時定量PCR(qRT-PCR) 取細胞,棄去培養基,離心后收集細胞,用Trizol試劑盒抽提細胞總RNA,反轉錄合成cDNA,反應體系為10 μL(2 μL 5x Reaction mix,1 μL Random primer,0.6 μL逆轉錄酶,5 μLRNA樣品),置于42 ℃、60 min,85 ℃下5 min滅活逆轉錄酶活性;將cDNA稀釋10倍按照實時熒光定量PCR試劑盒對Annexin A3進行擴增。反應體系為cDNA 10 μL,正向引物、反向引物各1 μL,SYBR Green/Flourescein qPCR Maxter Mix 10 μL,去離子水5.2 μL。反應條件:95 ℃,預熱3 min,95 ℃ 20 s ,60 ℃ 20 s,72 ℃ 10 s,上述3步驟40次循環,72 ℃ 5 min終止反應。Annexin A3以GAPDH為內參基因,引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。采用2-ΔΔCt算法計算Annexin A3 mRNA相對表達量,實驗重復3次。Annexin A3正向引物5′-GCGGCAGCTGATTGTTAAGGA-3′,反向引物5′-GAGTCATAGGGCCACCATGAGA-3′;GAPDH正向引物5′-AGCGAGCATCCCCCAAAGTT-3′,反向引物5′-GGGCACGAAGGCTCATCATT-3′。

1.2.5蛋白質免疫印跡 取各組細胞,棄去培養基,加入RIPA裂解液裂解后提取總蛋白,用BCA試劑盒測定總蛋白濃度后,轉移至PVDF膜上,加入適宜濃度的兔抗人一抗Annexin A3(1∶1 000),4 ℃孵育24 h、洗滌后加入HRP標記的二抗(羊抗兔IgG),室溫孵育1 h,洗滌,以GAPDH為內參,通過ECL顯影,凝膠成像系統照相并分析灰度值。試驗重復3次。

1.2.6流式細胞儀監測細胞凋亡 取培養48 h后的各組細胞,加入終濃度為5 g/L DDP培養48 h后,參照文獻[10]收集細胞,重懸制成單細胞懸液,加入50 mg/L異硫氰酸熒光素和碘化丙啶試劑各5 μL染色,用流式細胞儀檢測細胞凋亡。

1.2.7小鼠荷瘤實驗驗證白楊素對細胞耐藥性的影響 取(20±2)g的C57BL/6小鼠60只,分為A549組、A549/DDP組、白楊素組(50 mol/L)、Annexin A3過表達組(Annexin A3mimic組)、Annexin A3陰性對照組(Annexin A3 NC)及白楊素+Annexin A3 mimic組,每組10只,A549組小鼠經皮下注射0.2 mL/只(1×107個/mL)的A549細胞;7 d后,給予10 mg/kg DDP腹腔注射14 d,2次/d;A549/DDP組小鼠除注射細胞為A549/DDP細胞外,其余同A549組;白楊素組小鼠皮下注射等量A549/DDP細胞后7 d,給予10 mg/kg DDP腹腔注射的同時注射白楊素(50 mol/L,1 mL只)進行干預治療;Annexin A3 mimic組及Annexin A3 NC組小鼠分別皮下注射轉染Annexin A3mimic及Annexin A3 NC的A549/DDP細胞(0.2 mL/只,1×107個/mL)后7 d,給予相同劑量的DDP進行干預治療;白楊素+Annexin A3mimic組小鼠在Annexin A3mimic組基礎上給予白楊素(50 mol/L,1ml/只)進行干預治療。各組干預治療7 d后測量并計算瘤體體積。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 白楊素對A549、A549/DDP細胞毒性的影響

隨著白楊素濃度的上升,A549、A549/DDP細胞生存率逐漸降低、且白楊素5、25、50 mol/L組呈時效依賴性和劑量依賴性;用50 mol/L白楊素處理48 h時,A549、A549/DDP細胞生存率分別為51.36%、51.14%,接近IC50,因此將50 mol/L作為白楊素毒性適宜濃度,48 h作為最佳處理時間用于下游試驗。見圖1。

圖1 白楊素對A549、A549/DDP的IC50細胞毒性

2.2 Annexin A3基因及蛋白表達和DDP的IC50

與A549細胞組比較,A549/DDP細胞組Annexin A3基因及蛋白表達、對DDP的IC50升高,差異有統計學意義(P<0.05)。見圖2。

注：(1)與A549細胞組比較,P<0.05。

2.3 細胞耐藥性對DDP的影響

與A549組比較,A549/DDP組細胞IC50及耐藥指數升高(P<0.05);與A549/DDP組比較,白楊素組IC50及耐藥指數降低(P<0.05);Annexin A3 mimic組細胞IC50及耐藥指數進一步升高(P<0.05);與白楊素組比較,白楊素+Annexin A3 mimic組細胞IC50及耐藥指數升高(P<0.05)。見表1。

表1 各組細胞的IC50及耐藥指數

2.4 Annexin A3 mRNA及蛋白表達

與A549組比較,A549/DDP組細胞Annexin A3 mRNA及蛋白表達升高(P<0.05);與A549/DDP組比較,白楊素組細胞Annexin A3 mRNA及蛋白表達降低(P<0.05);細胞Annexin A3 mRNA及蛋白表達進一步升高(P<0.05);與白楊素組比較,白楊素+Annexin A3 mimic組細胞Annexin A3 mRNA及蛋白表達升高(P<0.05)。見圖3。

注：(1)與A549組比較,P<0.05;(2)與A549/DDP組比較,P<0.05;(3)與白楊素組比較,P<0.05。

2.5 細胞凋亡率

與A549組比較,A549/DDP組細胞凋亡率降低(P<0.05);與A549/DDP組比較,白楊素組細胞細胞凋亡率升高(P<0.05);Annexin A3 mimic組細胞凋亡率進一步降低(P<0.05);與白楊素組比較,白楊素+Annexin A3 mimic組細胞細胞凋亡率降低(P<0.05)。見圖4、表2。

表2 各組細胞凋亡率比較

圖4 各組細胞凋亡檢測

2.6 荷瘤小鼠瘤體體積

DDP干預治療后,與A549組比較,A549/DDP組小鼠瘤體體積增大(P<0.05);與A549/DDP組比較,白楊素組小鼠瘤體體積減少(P<0.05);Annexin A3 mimic組小鼠瘤體體積增大(P<0.05);與白楊素組比較,白楊素+Annexin A3 mimic組小鼠瘤體體積增大(P<0.05)。

表3 各組荷瘤小鼠瘤體體積

3 討論

肺腺癌是非小細胞型肺癌中發病率和死亡率最高的一類惡性腫瘤性疾病,目前,DDP化療仍是治療肺腺癌的主要手段,然而DDP耐藥問題越來越明顯,逐漸成為導致肺腺癌治療失敗的主要原因,大部分肺腺癌患者死亡與腫瘤細胞耐藥有著重要關系,因此如何解決腫瘤細胞對DDP藥物的耐藥性,提高化療藥物的療效,是國內外研究的熱點和難點問題[11]。

白楊素為蜂膠中主要成分,也是一種天然的植物黃酮類化合物,具有抗腫瘤抑制芳香酶活性、抗炎、抗氧化等多種藥理作用[12],其能夠抑制肺癌、肝癌、乳腺癌等多種癌細胞的增殖而受到國內外研究的重視[13]。近來研究報道白楊素可增強卵巢癌細胞對放射治療的感性[14],基于其抗腫瘤及放射增敏作用,本研究認為用白楊素改善肺腺癌細胞對DDP的耐藥性,可能是解決肺腺癌鉑類耐藥問題的潛在藥物。A549/DDP細胞是一種DDP耐藥細胞,本研究發現,白楊素不同濃度可呈劑量依賴性和時效性抑制A549、A549/DDP細胞的增殖能力,且用50 mol/L 濃度的白楊素處理A549/DDP細胞后,A549/DDP細胞對DDP的IC50由24.15 mg/L左右降至為6.57mg/L,耐藥指數由6.35左右降至1.75左右,提示白楊素可顯著降低A549/DDP細胞對DDP的耐藥性。Annexin A3是一種鈣離子依賴的磷脂結合蛋白[15],研究發現,其不僅可調控細胞增殖、凋亡而參與多種癌細胞的惡性生物學過程[16],還可通過凋亡途徑調控癌細胞對DDP的敏感性[17]。孫佳等[18]發現Annexin A3基因可在結腸癌細胞中有較高表達,而下調Annexin A3基因表達后可抑制結腸癌的增殖、遷移過程,證實了Annexin A3與腫瘤惡性生物學關系密切。Xu等[19]發現下調大腸癌耐藥細胞株中Annexin A3表達可顯著降低耐藥細胞株的存活,本研究發現A549/DDP細胞耐藥性高于A549細胞的同時,其Annexin A3基因及蛋白表達也明顯高于A549細胞。用白楊素干預處理后,A549/DDP細胞對DDP的IC50及耐藥指數降低的同時,Annexin A3基因及蛋白表達也顯著降低,提示白楊素降低A549/DDP細胞對DDP耐藥性作用,可能與下調Annexin A3基因及蛋白表達有關。為了進一步探究白楊素降低A549/DDP細胞對DDP耐藥性作用,本研究上調A549/DDP中Annexin A3基因表達后,發現A549/DDP細胞對DDP的耐藥性及耐藥指數進一步升高,白楊素促進A549/DDP凋亡、降低A549/DDP細胞對DDP的耐藥性作用也明顯被削弱,提示Annexin A3基因高表達,可能是A549/DDP細胞耐藥性升高的關鍵機制。Annexin A3基因過表達可逆轉白楊素的降低A549/DDP細胞對DDP的耐藥性作用。另外小鼠體內試驗,也證實一定濃度的DDP治療后,再進行白楊素干預治療,小鼠瘤體體積增長明顯低于單獨用DDP治療組,轉染Annexin A3基因高表達的A549/DDP細胞,再經白楊素及DDP治療,其瘤體體積增長仍然加快,進一步證實,白楊素降低A549/DDP細胞對DDP的耐藥性作用,可能與抑制Annexin A3表達有關。

綜上所述,白楊素可能通過下調Annexin A3的表達,降低A549/DDP細胞對DDP的耐藥性,為治療DDP耐藥型肺癌提供方向。然而A549/DDP細胞耐藥性升高的作用,也可能與機體免疫逃逸的發生有關,白楊素也可能通過調節免疫來降低A549/DDP細胞對DDP耐藥性,這有待后續進一步探究。