LncRNA NNT-AS1通過miR-582-5p/MCL1對肝癌細胞侵襲和轉移的影響*

孫波, 周雷, 周東亞, 王小龍, 徐超, 呂瑩, 劉犇

(南京中醫藥大學沭陽附屬醫院 腫瘤科, 江蘇 宿遷 223600)

肝癌是全球最常見的癌癥死亡原因之一,也是中國第4大最常見的癌癥死亡原因[1-2]。肝癌的預后很差,即使經過手術切除和標準化治療,其復發率和轉移率仍然很高[3-4]。因此,深入研究肝癌防治的新靶點,對提高肝癌的早期診斷和臨床預后具有重要意義。長非編碼RNA(lncRNA)是一類非蛋白質編碼RNA轉錄物,長度超過200個核苷酸,被認為是癌癥生物學中的新型調控因子[5]。異常表達的lncRNA通過轉錄或轉錄后基因調控影響癌細胞的增殖、轉移、自我更新和凋亡,促進多種癌癥類型的發生發展[6]。有證據表明lncRNA可能是癌癥檢測的有效生物標志物,包括肝癌在內的多種癌癥類型的致瘤性都涉及各種lncRNA[7-8]。其中,LncRNA NNT-AS1是一種新鑒定的lncRNA,位于3個外顯子的5p12處,被認為是肝癌致癌基因[9]。NNT-AS1在肝癌發展中的機制研究極為匱乏。lncRNA通過降低其靶miRNA的水平在人類腫瘤中發揮作用已被廣泛接受。據報道,NNT-AS1通過抑制miR-22-3p增強肺癌細胞的增殖、遷移和侵襲[10]。此外,lncRNA牛磺酸上調基因1通過海綿miR-582-5p促進肝癌進展[11]。有研究表明,miR-582-5p在肝癌中表達降低[12],NNT-AS1是否通過調控miR-582-5p來影響肝癌進展仍不明確。MCL1是抗凋亡BCL-2家族蛋白的關鍵成員,MCL1的獨特之處在于其有效的泛素化和破壞作用,并且具有促進腫瘤侵襲和轉移的功能[13]。目前MCL1在肝癌進展中的作用機制還不明確,是否由LncRNA/miRNA介導和調節也不清楚。因此本研究旨在探討NNT-AS1、miR-582-5p和MCL1對肝癌細胞侵襲和轉移的影響。

1 材料與方法

1.1 細胞培養

選擇正常肝細胞L-02細胞和肝癌細胞MHCC97H、LM3、SMCC7721、Huh7、Hep3B(購于ATCC,中國)進行培養。置于37 ℃、5%CO2細胞培養箱(型號thromo3111,美國)中,用含10% 胎牛血清(Gibco,美國)的RPMI1640培養基(Gibco,美國)培養,每天更換培養基,3～4 d傳代。選擇處于對數生長期并且生長狀態較好的細胞進行實驗。

1.2 細胞分組及轉染

取對數期生長的人肝癌Huh7細胞系 按1×105/孔密度接種于6孔培養板內,轉染前1 d用不含血清和雙抗的RPMI 1640培養基培養將細胞分組并轉染:Control組(不做處理細胞)、si-NC組、si-NNT-AS1組、NC mimics組、miR-582-5p mimics組、si-NC+NC mimic、si-NNT-AS1+NC mimics、si-NC+miR-582-5p mimics組、si-NNT-AS1+miR-582-5p mimics組、si-NNT-AS1+oe-NC及si-NNT-AS1+oe-MCL1組,按照Lipofectamine 2000說明書進行轉染,將50 ng si-NNT-AS1、miR-582-5p mimics、oe-NC或NC(上海吉瑪公司,中國)快速離心,與170 μL磷酸鹽緩沖液(賽默飛世爾,USA)混勻后,靜置5 min,加入Lipofectamine 2000 8 μL(thromo,美國),輕微震蕩充分混勻后,室溫下靜置20 min,5 μmoL/L DAPT添加后加入到6孔板中,輕輕混勻,8 h換為含10%胎牛血清的培養基(Gibco,美國)。轉染48 h后,收集細胞用于后續實驗。

1.3 觀察指標

1.3.1qRT-PCR檢測NNT-AS1、miR-582-5p、MCL1表達水平 收集轉染48 h后的各組細胞,Trizol(貨號16096020,賽默飛世爾科技,紐約,美國;貨號B1802,哈爾濱新海基因檢測有限公司,中國)提取總RNA。TaqMan MicroRNA Assays Reverse Transcription Primer(Thermo scientific公司, USA)逆轉錄合成cDNA。SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ試劑盒(行知生物科技有限公司,中國)進行熒光定量PCR檢測。依次加入以下組分: SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ(2×)25 μL, PCR上、下游引物各2 μL,ROX Reference Dye(50×)l μL, DNA模板4 μL, ddH2O16 μL。在ABI PRISM?7300(型號Prism?7300,上海坤科儀器設備有限公司,中國)系統進行熒光定量PCR。反應條件:95 ℃預變性10 min,95 ℃變性15 s,60 ℃退火30 s,循環32次后72 ℃延伸1 min。ΔCt = CT(目的基因)-CT(GAPDH),ΔΔCt=ΔCt(實驗組)-ΔCt(對照組),基因以U6為內參,用2-ΔΔCt表示各目的基因相對表達量。引物見表1。

表1 qRT-PCR引物序列

1.3.2Western blot檢測 MCL1蛋白表達 細胞轉染培養48 h后,預冷的PBS洗3遍,使用含PMSF的RIPA裂解液(R0010,solarbio)提取細胞中總蛋白。BCA試劑盒(thromo,美國)測定蛋白濃度,去離子水調零。樣品與上樣緩沖液混合,100 ℃金屬浴煮10 min,點樣時加入50 μg蛋白樣品,以70 V恒壓電泳3 h。濕轉法將蛋白轉移至PVDF膜(ISEQ00010,Millipore,Billerica,MA,USA)上,恒流150 mA轉膜。5%脫脂奶粉4 ℃室溫封閉2 h;棄去牛奶,TBST洗去牛奶,用一抗兔抗人MCL1(ab32087,1∶2 000)、GAPDH(ab8226,1∶2 000,Abcam,UK)4 ℃孵育過夜,TBST洗3次,每次6 min。HRP 標記的羊抗兔IgG抗體(北京中山生物技術有限公司,1∶5 000稀釋)孵育2 h。TBST洗3次、每次6 min,洗后泡在TBS中。取ECL熒光檢測試劑盒(貨號BB-3501,Ameshame公司,英國)中A液和B液,等體積混勻,200 μL滴加在膜上,在凝膠成像儀中曝光成像。用Bio-Rad圖象分析系統(美國BIO-RAD公司)照相,用Image J軟件分析,以相應蛋白條帶的灰度值/GAPDH蛋白條帶的灰度值表示相對蛋白含量。

1.3.3RIP檢測NNT-AS1和miR-582-5p結合 采用RIP試劑盒(millipore,USA)檢測NNT-AS1和miR-582-5p結合情況。用預冷PBS洗神經元后棄上清。用等體積的RIPA裂解液(P0013B,碧云天)冰浴5 min裂解細胞,14 000 r/min,4 ℃離心10 min取上清。細胞提取液一部分取出作為input,一部分與抗體孵育進行共沉淀。具體步驟:每一個共沉淀反應體系取50 μL磁珠清洗后重懸于 RIP Wash Buffer100 μL中,依據實驗分組加入5 μg抗體孵育以便結合。磁珠-抗體復合物經清洗后與重懸于RIP Wash Buffer900 μL ,加入100 μL細胞提取液4 ℃孵育過夜。樣品置于磁座上收集磁珠-蛋白復合物。樣品及Input分別經蛋白酶K消化后提取RNA,PCR檢測NNT-AS1和miR-582-5p結合。RIP所用抗體為:AGO2(ab32381,1∶1 000,Abcam,UK),室溫混勻30 min,IgG(1∶100,ab109489)作為陰性對照。

1.3.4生物信息學網站和雙熒光素酶報告基因實驗 首先經過生物學預測網站(www.targetscan.org)進行miR-582-5p與MCL1結合位點的分析。接下來通過雙熒光素酶報告系統驗證miR-582-5p與MCL1的靶向關系。構建靶基因MCL1雙熒光素酶報告基因載體與miR-582-5p結合位點突變的突變體:MCL1wt和MCL1mut。將Rellina質粒和兩種報告質粒分別與miR-582-5p mimics和NC mimics質粒共轉染到HEK293T細胞中。將Rellina質粒和兩種報告質粒分別與miR-582-5p mimics質粒和NC mimics質粒共轉染到HEK293T細胞中,在細胞轉染24 h后,進行雙熒光素酶檢測。首先將各組細胞裂解,裂解后以12 000 g離心1 min,去沉淀,收集上清液。雙熒光素酶報告試劑盒購自Promega,按照試劑盒操作,測量熒光素酶活性。操作步驟如下:將裂解后的細胞樣品吸入EP管中,每10 μL樣品中螢火蟲熒光素酶工作溶液100 μL,測得螢火蟲熒光素酶之后加入海腎熒光素酶工作溶液100 μL,測得海腎熒光素酶結果。相對熒光素酶活性=螢火蟲熒光素酶/海腎熒光素酶。

1.3.5Transwell檢測細胞遷移和侵襲能力 采用trans-well培養系統檢測細胞的遷移和侵襲能力。使用涂有Matrigel(BD Biosciences Discovery Labware,Woburn,MA,USA)的上腔室的透孔膜;在37 ℃的培養箱中,用無血清培養基將小室再水化2 h。隨后將頂部室用200 uL細胞懸浮液(含有1×105個細胞)水合。在底部室中加入500 uL含有10%FBS作為化學吸引劑的培養基。在37 ℃下培養24 h后,將膜下表面的跨膜細胞在室溫下用甲醛固定5 min,用結晶紫染色20 min,用清水洗滌3次,并在顯微鏡下計數。

1.4 統計學分析

2 結果

2.1 肝癌細胞系中NNT-AS1和miR-582-5p表達

qRT-PCR結果顯示,與肝細胞L-02比較,MHCC97H、LM3、SMCC7721、Huh7、Hep3B細胞中NNT-AS1表達升高,miR-582-5p表達降低,差異有統計學意義(P<0.05);其中Huh7細胞中NNT-AS1表達量最高,選擇該細胞進行后續實驗。見圖1。

注：(1)與肝細胞L-02比較,P<0.05。

2.2 沉默NNT-AS1和過表達miR-582-5p對肝癌細胞株Huh7侵襲和轉移的影響

為探究NNT-AS1對肝癌細胞株Huh7侵襲和轉移的影響,分別對Huh7細胞進行NNT-AS1和miR-582-5p沉默和過表達處理,并通過transwell檢測各組細胞的侵襲和轉移情況。結果顯示,與si-NC組比較,si-NNT-AS1組細胞侵襲和轉移能力顯著降低,差異有統計學意義(P<0.05);與NC mimics組比較,miR-582-5p mimics組細胞侵襲和轉移能力顯著降低,差異有統計學意義(P<0.05)。見圖2。

注：A為transwell轉移與侵襲圖(結晶紫染色,×200),B為各組細胞轉移細胞數量統計分析,C為各組細胞侵襲細胞數量統計分析;(1)與si-NC組比較,P<0.05;(2)與NC mimics組比較,P<0.05。

2.3 NNT-AS1對海綿miR-582-5p的吸附情況

通過生信篩選發現LncRNA NNT-AS1和miR-582-5p存在結合位點。為探究NNT-AS1和miR-582-5p之間的關系,RIP實驗驗證NNT-AS1與miR-183-5p的結合能力(圖3);與IgG(1.00±0.04)比較,AGO2(1.54±0.06)結合的miR-183-5p的量顯著增多,差異有統計學意義(P<0.05),提示NNT-AS1可海綿吸附miR-582-5p。

注：A為transwell轉移與侵襲圖(結晶紫染色,×200),B為各組細胞轉移細胞數量統計分析,C為各組細胞侵襲細胞數量統計分析;(1)與si-NC+NC mimic組比較,P<0.05;(2)與si-NNT-AS1+NC mimics組比較,P<0.05。

2.4 NNT-AS1吸附miR-582-5p在肝癌細胞株Huh7侵襲和轉移的影響

transwell檢測各組肝癌細胞株Huh7的侵襲和轉移情況,結果顯示,與si-NC+NC mimic比較,si-NNT-AS1+NC mimics組Huh7細胞侵襲和轉移能力顯著減弱,si-NC+miR-582-5p mimics組Huh7細胞侵襲和轉移能力顯著降低,差異有統計學意義(P<0.05);與si-NNT-AS1+NC mimics比較,si-NNT-AS1+miR-582-5p mimics組Huh7細胞侵襲和轉移能力顯著降低,差異有統計學意義(P<0.05)。見圖3。

2.5 miR-582-5p靶向結合MCL1

生信網站分析發現miR-582-5p與 MCL1存在結合位點。雙熒光素酶報告檢測發現,miR-582-5p與突變的MCL1的3′-UTR共轉染后差異無統計學意義(P>0.05),而miR-582-5p與野生型的MCL1的3′-UTR共轉染后螢光素酶活性明顯降低,差異有統計學意義(P<0.05)。見圖4。結果提示,MCL1是miR-582-5p的下游靶基因。

注：(1)與NC mimics組比較,P<0.05。

2.6 miR-582-5p對MCL1表達的影響

qRT-PCR結果顯示,與NC mimics(1.00±0.05)組比較,miR-582-5p mimics(0.24±0.03)組Huh7細胞中MCL1表達明顯下調,差異有統計學意義(P<0.05)。

2.7 肝癌細胞系中MCL1表達

Western blot結果顯示,與肝細胞L-02比較,MHCC97H、LM3、SMCC7721、Huh7、Hep3B細胞MCL1表達明顯升高,差異有統計學意義(P<0.05)。見圖5。

注：A為各組細胞MCL1的蛋白條帶圖,B為各組細胞MCL1的蛋白水平統計圖;(1)與肝細胞細胞L-02比較,P<0.05。

2.8 NNT-AS1/MCL1在肝癌細胞的侵襲與轉移中的作用

將肝癌細胞株Huh7中NNT-AS1沉默后,再將MCL-1過表達,采用transwell檢測沉默MCL1后細胞的侵襲和轉移情況。結果顯示,與si-NNT-AS1+oe-NC組比較,si-NNT-AS1+oe-MCL1組Huh7細胞侵襲和轉移能力顯著增強,差異有統計學意義(P<0.05)。見圖6。提示MCL-1能夠恢復NNT-AS1沉默對肝癌細胞的侵襲和轉移能力的抑制。

注：A為transwell轉移與侵襲圖(結晶紫染色,×200),B為各組細胞轉移細胞數量統計分析,C為各組細胞侵襲細胞數量統計分析;(1)與si-NNT-AS1+oe-NC組比較,P<0.05。

3 討論

肝癌細胞具有很強的轉移能力,并且在早期階段患者是沒有明顯癥狀的,一般發現時已有伴有淋巴結遠處轉移[14-15]。而肝癌的致病原因難以追蹤,因而探究肝癌發生進程中的分子機制以及研發出具有廣譜性的分子靶點和治療藥物是目前亟待解決的問題。隨著高通量RNA測序和生物信息學分析的發展,已經報道了許多新發現的lncRNA在多種腫瘤發生過程中起癌基因或抑癌作用。例如,lncRNA SNHG1在肝癌組織和細胞系中顯著上調,并通過抑制miR-195促進肝癌細胞增殖,侵襲和遷移[16]。LincRNA-p21在肝癌組織和細胞中被下調,而lincRNA-p21的表達增強可以抑制Notch信號和上皮-間質轉化[17]。miRNA是細胞正常發育過程中決定細胞命運的重要因素[18-19],MCL-1是一種獨特的抗凋亡Bcl2家族蛋白,在控制癌細胞凋亡和生存方面起著看門人的作用,目前已在多種癌癥中觀察到MCL-1受體及其配體在腫瘤細胞中異常高表達[20]。目前多個報道證實,LncRNA NNT-AS1在癌癥中異常高表達,且通過吸附miRNA,調節下游靶基因的表達,對腫瘤細胞生命活動發揮其影響。本研究選擇正常肝細胞L-02細胞和肝癌細胞株MHCC97H、LM3、SMCC7721、Huh7、Hep3B,檢測NNT-AS1在正常細胞和5種肝癌細胞中的表達,發現NNT-AS1在五種癌細胞中較正常細胞表達明顯較高。根據文獻調研和生信分析,NNT-AS1可結合并吸附miR-582-5p,通過實驗發現,miR-582-5p在5種癌細胞中較正常細胞表達明顯較低,隨后干擾NNT-AS1并且過表達miR-582-5p發現肝癌細胞Huh7的侵襲和轉移能力明顯被抑制,且同時作用時,抑制作用更強。為進一步探討miR-582-5p下游的調控機制,通過生信預測到MCL-1是miR-582-5p的下游靶基因,并且從多個已發表文獻來看,MCL-1在腫瘤中高表達,通過雙熒光素酶報告基因實驗驗證MCL-1是miR-582-5p的下游靶基因,兩者之間確實存在靶向關系,并且通過將肝癌細胞株Huh7中NNT-AS1沉默后,將MCL-1過表達,發現MCL-1能夠恢復肝癌細胞Huh7的侵襲和轉移能力。這與之前所報導的文獻結果一致。

本研究證明NNT-AS1可結合并吸附miR-582-5p介導MCL-1來抑制肝癌細胞的侵襲和轉移。此次研究,進一步闡明了肝癌的發展機制和分子網絡,為臨床肝癌的靶向治療和分子藥物的研發奠定了理論基礎。為進一步確認以上結果,還需進一步進行MCL-1的功能回補實驗和動物實驗。然而,到目前為止,MCL-1與肝癌之間的聯系還沒有被完全解釋清楚,LncRNA NNT-AS1對肝癌的影響是否還有其他路徑,MCL-1是通過何種分子機制實現對肝癌細胞發生影響目前尚未探究清楚,后續還有很多工作亟待開展。