艷山姜揮發油對四氧嘧啶誘導的胰島細胞損傷保護作用及機制*

文波, 羅芳, 付凌云, 徐旖旎, 陶玲, 張甜, 林浩恒, 沈祥春**

(1.貴州醫科大學 藥學院 天然藥物資源優效利用重點實驗室 &貴州省高等學校天然藥理與成藥性評價重點實驗室, 貴州 貴陽 550025; 2.貴州醫科大學附屬醫院 神經內科, 貴州 貴陽 550001)

糖尿病(diabetic mellitus, DM)是一種在全球范圍內廣泛流行的體內胰島素的相對或絕對分泌不足引起的糖、脂及蛋白質代謝紊亂,伴有多種并發癥且尚無法根治的內分泌疾病[1-4],其中2型糖尿病占DM總發病率的90%[5]。DM的病理生理機制主要包括胰島細胞受損和胰島素抵抗兩個方面。NIT-1細胞是胰島細胞的一種,通過分泌胰島素調節機體血糖,在DM的形成中發揮關鍵性作用。胰島功能受損是2型糖尿病的主要特征之一[6],四氧嘧啶通過產生超氧自由基選擇性地破壞NIT-1細胞,使其數目減少、功能受損,從而胰島素分泌減少,進一步導致DM的產生。因此,抑制胰島細胞數量減少和恢復胰島正常功能對治療DM及減少并發癥的發生有著重要作用。艷山姜源于姜科植物艷山姜Alpiniazerumbet(Pers.)Burtt.et Smith的干燥成熟果實,主要含有揮發油類、黃酮類和二萜類等成分[7-8]。本實驗室以往研究證實,艷山姜揮發油(essential oil from fructusalpiniaezerumbet, EOFAZ)具有廣泛的抗高血壓、抗動脈粥樣硬化、抗炎鎮痛、抗氧化、抗高尿酸等心血管藥理活性[9-14]。本研究在前期研究的基礎上,結合DM發生過程中關鍵細胞的病變特征,探討EOFAZ對四氧嘧啶誘導NIT-1胰島細胞凋亡的保護作用及可能的機制,以期為貴州民族藥艷山姜的進一步開發應用提供實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1細胞株 大鼠胰島細胞(NIT-1)株購自于美國American Type Culture Collection公司。

1.1.2藥物 利用水蒸氣蒸餾法提取EOFAZ后,精密稱取30 μL(約29 mg),加二甲基亞砜2.9 mL溶解,配制成10 g/L的母液,0.22 μm微孔濾膜除菌,放置4 ℃備用。實驗時用無血清培養基稀釋成不同濃度給藥。

1.1.3主要試劑 MTT(美國Sigma),四氧嘧啶(美國Aldrich),丙二醛(malondialdehyde, MDA)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase, GSH-PX)、乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase dehydrogenase, LDH)以及胰島素檢測試劑盒(南京建成),RPMI-1640培養基、胰蛋白酶以及RIPA裂解液(美國Gibco),B淋巴細胞瘤-2(B-cell lymphoma-2, Bcl-2)、Bcl-2關聯X蛋白(BCL2-associated X, Bax)以及半胱氨酸-天冬氨酸特異性蛋白酶9(cysteinyl aspartate specific proteinase, Caspase-9)抗體(美國Cell signaling Technology),羊抗鼠、羊抗兔IgG抗體(美國Santa Cruz),Z-VAD-FMK抑制劑(上海碧云天),ECL發光液(美國Thermo scientific)。

1.1.4主要儀器 SW-CJ2FD雙人單面凈化工作臺(浙江孚夏),BXM-30R立式壓力蒸汽滅菌器(上海博訊),170-3930垂直電泳系統、CFX凝膠成像系統(美國Bio-Rad),ELX800酶聯免疫檢測儀(美國伯騰),5424R低溫冷凍離心機(德國eppendorf),CKX53倒置相差顯微鏡(日本Olympus),700-SERIES超低溫冰箱(美國Thermo scientific),MCO-18AC CO2細胞培養箱(蘇州凈化),IMS-50制冰機(常熟市雪科電器),Milli-Q型純水機(武漢天恒)。

1.2 研究方法

1.2.1NIT-1細胞培養 液氮中取出NIT-1細胞立即放入37 ℃水浴中以迅速解凍。隨后接種于培養瓶中,加入含10% 胎牛血清的RPMI-1640培養基,于37 ℃,5% CO2飽和濕度條件的培養箱中培養,隔夜換液。待其生長約80%,用0.25%的胰酶消化,培養基中和后離心棄上清,計數后加新鮮培養基完成傳代。取對數生長期細胞用于后續實驗。

1.2.2四氧嘧啶誘導NIT-1細胞損傷濃度的篩選 將處于對數生長期的NIT-1細胞以1×105個/mL密度接種到96孔板中,每孔100 μL。培養后24 h換液,待其長滿后,加入濃度分別為0、1、4、10、20、40、60、80、100 mmol/L的四氧嘧啶,每種濃度設6個復孔,培養24 h后進行MTT檢測。各孔加入5 g/L MTT 20 μL,繼續孵育4 h,棄上清,每孔加 DMSO溶液150 μL,于低速搖床上震蕩10 min,使藍色結晶完全溶解。在酶標儀490 nm波長處測定各孔OD值,根據每孔OD值計算各組細胞存活率,確定造模濃度。實驗重復3次。計算公式如下:細胞存活率=(給藥組OD值-空白調零組OD值)/(對照組OD值-空白調零組OD值)×100%。

1.2.3分組與給藥 根據實驗室前期研究結果確定EOFAZ的給藥劑量[9,15]。實驗分為5組:對照組(無血清培養基)、模型組(40 mmol/L四氧嘧啶)、EOFAZ低劑量組(50 μg/L EOFAZ+40 mmol/L四氧嘧啶)、EOFAZ中劑量組(100 μg/L EOFAZ+40 mmol/L四氧嘧啶)以及EOFAZ高劑量組(200 μg/L EOFAZ+40 mmol/L四氧嘧啶)。機制研究分為5組:對照組(無血清培養基)、模型組(40 mmol/L四氧嘧啶)、EOFAZ組(200 μg/L EOFAZ+40 mmol/L四氧嘧啶)、Z-VAD-FMK組(10 μmol/L Z-VAD-FMK+40 mmol/L四氧嘧啶)、EOFAZ+Z-VAD-FMK組(200 μg/L EOFAZ+10 μmol/L Z-VAD-FMK+40 mmol/L四氧嘧啶)。按照對應分組給藥,進行后續指標檢測。

1.2.4MTT法檢測細胞存活率 將細胞接種于96孔板中,待生長密度約80%時,按照方法“1.2.3”項處理,每組6個復孔;隨后按“1.2.2”項下MTT檢測步驟測定細胞存活率。

1.2.5生化法檢測MDA、SOD和GSH-PX的含量 將細胞接種于96孔板中,按照方法“1.2.3.”項處理。收集細胞上清液后,根據試劑盒說明書檢測細胞上清液中MDA、SOD、GSH-Px的含量。

1.2.6ELISA法檢測LDH和胰島素分泌量 將細胞接種于96孔板中,按照方法“1.2.3”項處理。收集細胞上清液后,根據試劑盒說明書檢測細胞上清液中LDH的外漏量和胰島素的分泌量。

1.2.7Western Blot檢測分析Bcl-2、Bax以及Caspase-9蛋白的表達 將細胞接種于6孔板中,按照“1.2.3”項處理后,PBS潤洗3次棄去孔內液體,加入細胞裂解液與PMSF蛋白抑制劑裂解細胞,離心后收集上清,BCA法定量,變性分裝后采用SDS-PAGE法進行電泳。充分分離蛋白轉移至PVDF膜,BSA封閉1.5 h,加入稀釋比為1∶1 000的Bax、Bcl-2、Caspase-9、β-actin抗體冰箱孵育過夜。次日回收一抗,清洗后加稀釋比為1∶10 000的二抗室溫孵育2 h,回收二抗,洗滌3次,ECL顯影,采用凝膠成像系統進行成像和數據分析。以β-actin作為內參進行歸一化處理,計算蛋白的表達量。實驗重復3次。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 NIT-1細胞損傷模型

采用濃度為1、4、10、20、40、60、80、100 mmol/L的四氧嘧啶分別作用于NIT-1細胞后,細胞存活率呈濃度依耐性降低。與0 mmol/L的四氧嘧啶組細胞比較比較,從4 mmol/L四氧嘧啶濃度從4 mmol/L開始,之后各濃度組細胞存活率下降,差異有統計學意義(P<0.05)。本實驗選擇40 mmol/L(存活率為70.7%)為誘導細胞最佳損傷濃度。見表1。

表1 不同濃度四氧嘧啶對NIT-1細胞存活率的影響

2.2 EOFAZ對NIT-1細胞存活率的影響

與對照組比較,模型組NIT-1細胞存活率降低,差異有統計學意義(P<0.05);與模型組比較,EOFAZ各劑量組NIT-1細胞存活率升高,差異有統計學意義(P<0.05)。見圖1。

注：(1)與對照組比較,P<0.05;(2)與模型組比較,P<0.05。

2.3 EOFAZ對NIT-1細胞MDA、SOD、GSH-PX和LDH水平的影響

與對照組比較,模型組NIT-1細胞中MDA和LDH含量增加,SOD和GSH-PX含量降低,差異有統計學意義(P<0.05);與模型組比較,除EOFAZ低劑量組MDA和SOD比較差異無統計學意義外(P>0.05),其余劑量組MDA和LDH含量降低(P<0.05),SOD和GSH-PX含量升高(P<0.05)。見圖2。

注：(1)與對照組比較,P<0.05;(2)與模型組比較,P<0.05。

2.4 EOFAZ對NIT-1細胞胰島素分泌的影響

與對照組比較,模型組胰島素分泌減少(P<0.05);與模型組比較,EOFAZ各劑量組胰島素分泌增多(P<0.05)。見圖3。

注：(1)與對照組比較,P<0.05;(2)與模型組比較,P<0.05。

2.5 EOFAZ對NIT-1細胞中Bax、Bcl-2和Caspase 9蛋白表達的影響

與對照組比較,模型組 Bax和Caspase 9蛋白表達上調(P<0.05),Bcl-2蛋白表達下調(P<0.05),Bax/Bcl-2升高(P<0.05);與模型組比較,除EOFAZ低劑量組Bcl-2蛋白表達比較差異無統計學意義外(P>0.05),其余劑量組Bax和Caspase 9蛋白表達下調(P<0.05),Bcl-2蛋白表達上調(P<0.05),Bax/Bcl-2降低(P<0.05)。見圖4。

注：A為蛋白條帶圖,B-E分別為Bax、Bcl-2、Bax/Bcl-2及Caspase-9蛋白的定量表達; (1)與對照組比較,P<0.05;(2)與模型組比較,P<0.05。

2.6 Caspase抑制劑作用下EOFAZ對四氧嘧啶誘導NIT-1細胞Caspase-9蛋白表達的影響

與對照組比較,模型組Caspase 9蛋白表達上調(P<0.05);與模型組比較,EOFAZ組Caspase 9蛋白表達下調(P<0.05);與EOFAZ組、Z-VAD-FMK組分別比較,EOFAZ+Z-VAD-FMK組Caspase 9蛋白表達均下調(P<0.05)。見圖5。

注：A為蛋白條帶圖,B為Caspase-9蛋白的定量表達;(1)與對照組比較,P<0.05;(2)與模型組比較,P<0.05;(3)與EOFAZ組比較,P<0.05;(4)與Z-VAD-FMK比較,P<0.05。

3 討論

胰島細胞損傷、胰島素分泌不足是導致DM的關鍵病理過程。各種因素如外界刺激(如高糖高脂)、炎癥、氧化應激等均可引起胰島細胞損傷,導致細胞膜通透性改變、細胞凋亡相關通路被激活,主要表現為細胞收縮、體積變小、胞質密集、細胞器和染色質聯系更為緊密、胞核碎裂以及凋亡小體形成[16]。四氧嘧啶是自由基活性劑,主要通過產生超氧自由基破壞胰島β細胞導致胰島素合成減少,從而使機體血糖升高。腹腔給予四氧嘧啶構建糖尿病動物模型的成功率在90%以上,因此可用于復制2型糖尿病模型[17-19]。機體通過維持氧化系統和抗氧化系統的平衡保證正常功能。LDH可反應細胞損傷程度,當細胞損傷時,細胞內過氧化物質如ROS、MDA、CAT增多,而抗氧化物質如SOD、GSH-PX等減少。本研究發現,EOFAZ干預后,MDA含量和LDH外漏量具有不同程度減少,而SOD和GSH-PX增多,提示EOFAZ可通過加強細胞清除自由基的能力,減少細胞氧化應激損傷,從而發揮保護作用。此外,胰島素檢測結果表明,EOFAZ作用后,胰島素分泌增多,提示其可通過減少損傷恢復胰島細胞功能促進胰島素的釋放。

在細胞凋亡過程中,凋亡蛋白分子發揮調控作用,Caspase蛋白的活化是導致細胞凋亡的中心環節。Caspase-9是內源性或線粒體凋亡途徑的凋亡起始蛋白酶,也是Caspase家族的重要代表,可啟動和觸發內在細胞凋亡信號然后傳遞到下游,誘導細胞級聯損傷,引起細胞死亡[20-21]。Bax與Bcl-2屬于同一家族,兩者之間的比例關系是決定對細胞凋亡抑制作用強弱的關鍵因素[22],當細胞損傷或凋亡時,Bax表達異常增多,Bcl-2表達異常減少,從而導致Bax與Bcl-2的比值(Bax/Bcl-2)異常降低。本研究發現,經過EOFAZ預處理后能明顯增加細胞中抗凋亡蛋白Bcl-2的表達水平,減少Bax和Caspase-9凋亡蛋白的表達水平,且Bax與Bcl-2的比值統計結果也證實了EOFAZ能改善兩者之間的異常表達狀態。為進一步明確其作用與抑制凋亡是否相關,本實驗繼續采用了凋亡蛋白有效抑制劑Z-VAD-FMK進行驗證。結果顯示,當采用EOFAZ聯用凋亡蛋白抑制劑后,Caspase-9表達進一步降低。提示EOFAZ可協同Z-VAD-FMK抑制Caspase-9蛋白表達,證實EOFAZ抑制四氧嘧啶誘導NIT-1的損傷與抑制細胞凋亡密切相關。盡管當前研究對于EOFAZ保護NIT-1細胞損傷的作用和機制有了一定的認識,但仍不深入,是否通過其他信號通路發揮作用有待進一步研究,有望有更多發現其可能具備潛在的降血糖的功能。

綜上所述,EOFAZ對四氧嘧啶誘導的NIT-1細胞損傷具有保護作用,其機制與提高胰島細清除自由基的能力和抑制細胞凋亡作用有關。