PMN-MDSCs細胞對異基因造血干細胞移植術后患者T淋巴細胞增殖及干擾素-γ分泌的影響*

陳璐, 倪明, 王力, 潘成云, 亢倩, 詹雲, 趙鵬, 王季石,3***

(1.貴州醫科大學附屬醫院 血液內科, 貴州 貴陽 550001; 2.貴州醫科大學 臨床醫學院, 貴州 貴陽 550004; 3.蘇州大學附屬第一醫院 國家血液病臨床研究中心, 江蘇 蘇州 215006)

異基因造血干細胞移植(allogeneic hematopoietic stem cell transplantation, allo-HSCT)術后可發生多種并發癥,其中較典型且嚴重的為移植物抗宿主病(graft-versus-host disease, GvHD)[1-3],Ⅱ及Ⅲ～Ⅳ度急性GvHD(acute GvHD, aGvHD)患者的3年生存率分別為54%和26%[4]。隨著免疫學研究的不斷進展,有學者認為免疫調節療法取代目前的免疫抑制療法是未來aGvHD治療所追求的目標[5]。髓系來源的抑制性細胞(myeloid-derived suppressor cells, MDSCs)是一群具有免疫抑制性的髓細胞,最主要的功能是抑制由固有免疫和獲得性免疫介導的反應[6]。大量研究表明,MDSCs已成為癌癥、感染、慢性炎癥及自身免疫性疾病中的主要免疫抑制細胞,提示MDSCs可能有助于控制GvHD[7-8]。目前,針對各亞型MDSCs通過不同機制預防及控制aGvHD的研究基本僅限于動物模型[9-10],體外實驗也僅限于現象學觀察,缺乏相關機制學研究[6,11]。因此,本研究主要通過流式分選出allo-HSCT術后患者新鮮外周血中多形核的MDSCs(polymorphonuclear-MDSCs, PMN-MDSCs)及T淋巴細胞,采用共培養方式探究人PMN-MDSCs對T淋巴細胞增殖、經典淋巴因子干擾素-γ(interferon-γ, IFN-γ)分泌的免疫抑制作用,為臨床PMN-MDSCs作為aGvHD防治策略提供理論和實驗依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1樣本來源及分組 選取2022年11月—2023年1月allo-HSCT術后患者16例及健康供者8例,要求符合術前接受清髓治療、術后臨床確診巨細胞病毒(cytomegalovirus, CMV)感染,排除行自體造血干細胞移植(autologous hematopoietic stem cell transplantation, AHSCT)術患者、臨床資料不完善者及患傳染性疾病(如乙肝、梅毒、艾滋病等)患者。取患者移植完成后第80天時及健康供者任意時間點新鮮外周血(未過夜)作為標本來源。本研究已根據《赫爾辛基宣言》獲得了病人以及供者知情同意。

1.1.2主要試劑及儀器 抗分化簇14抗體-APC(anti-cluster of differentiation 14-APC, anti-CD14-APC)、抗人類白細胞抗原DR抗體(anti-human leukocyte antigen-DR, anti-HLA-DR)及anti-CD11b(美國Thermo Fisher Scientific公司),anti-CD3、anti-CD16、anti-CD14-FITC、anti-CD15、anti-CD33、anti-CD19及 anti-CD4(美國Beckman Coulter公司),anti-CD8(中國QuantoBio公司),anti-CD3、anti-CD56、紅細胞裂解液及細胞破膜液(美國BD Biosciences公司),羧基熒光素琥珀酰亞胺酯(carboxyfluorescein succinimidyl ester, CFSE)細胞增殖與示蹤檢測試劑盒、CD3/28單抗偶聯磁珠(美國BioLegend公司),人白細胞介素-7(human interleukin-7, hIL-7)及人白細胞介素-15重組蛋白(human interleukin-15 recombinant protein, rhIL-15;美國Cell Signaling Technology公司),人外周血中性粒細胞分離液、瑞氏-姬姆薩復合染色試劑盒及Tween20(中國Solarbio公司),Annexin V-APC/7-AAD熒光雙染細胞凋亡檢測試劑盒(中國杭州聯科生物技術股份有限公司),螢光酶聯免疫斑點(enzyme-linked immunospot, ELISpot)試劑盒、CMV肽段池(cytomegalovirus peptide pool, CMV pool;美國Mabtech 公司),7-氨基放線菌素D(7-aminoactinomycin D, 7-AAD)、標準透明96孔U型底細胞培養板[中國愛必信(上海)生物科技有限公司],1×磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered solution, PBS;中國蘭杰柯科技有限公司),Roswell Park Memorial Institute(RPMI)-1640培養基、青霉素-鏈霉素混合液(中國武漢普諾賽生命科技有限公司),胎牛血清(fetal bovine serum, FBS;中國浙江天杭生物科技股份有限公司),完全培養基配方為RPMI-1640 45 mL+FBS 5 mL+青霉素-鏈霉素混合液500 μL,5 mL流式試管(墨西哥FALCON公司),流式分選儀和流式細胞儀(美國BD Biosciences公司),CX41型顯微鏡(日本OLYMPUS公司),熒光酶聯免疫斑點分析儀(德國BIO-SYS公司)。

1.2 研究方法

1.2.1血液標本 抽取allo-HSCT術后患者移植完成后第80天時及健康供者任一時間點的空腹外周血。

1.2.2分離PMN-MDSCs與T細胞 2組受檢者新鮮外周血標本置于50 mL試管中,加預先放置的中性粒細胞分離液10 mL,室溫下1 800 r/min離心30 min,吸出分層的2層細胞(包含了所有白細胞),1×PBS緩沖液洗滌2次(2 000 r/min離心5 min)。

1.2.3分選PMN-MDSCs與T細胞/PMN-MDSCs 取“1.2.2”項下2組受檢者白細胞置于5 mL流式試管中,室溫下2 000 r/min離心5 min,1×PBS緩沖液50 μL重懸,分別加PMN-MDSCs及T細胞的分選抗體組合,即對于PMN-MDSCs使用CD33、CD11b、HLA-DR及CD14-APC,對于T細胞則使用CD3、CD16、CD56、CD14、CD15、CD33及CD19進行染色,常溫避光孵育15 min;1×PBS緩沖液500 μL洗滌細胞1次,加1×紅細胞裂解液1mL裂解紅細胞,常溫避光孵育10 min;1×PBS緩沖液洗滌,完全培養基重懸。遵循FACS Melody手冊建立無菌管路,使用無菌生理鹽水作為鞘液進行分選,承接分選細胞的無菌流式管中預先加FBS 2 mL,收集細胞數上限為7.2×105個/管;分選結束后立刻迅速將細胞轉移至37 ℃、5% CO2培養箱中備用。

1.2.4瑞氏-姬姆薩(Weigert-Giemsa, WG)染色 取“1.2.3”項下2組受檢者PMN-MDSCs混勻滴至載玻片、推片、常溫晾干,使用移液器懸滴WG染色液(A液)至載玻片、覆蓋涂片區、常溫孵育3～5 min;滴加等量WG緩沖液(B液),晃動玻片與A液均勻混合,再使用60 mL洗耳球充分混勻A、B液,常溫孵育3～5 min;生理鹽水洗去染色劑,玻片于常溫晾干;用顯微鏡閱片(放大倍數為100倍),比較allo-HSCT術后患者及健康供者PMN-MDSCs形態學差異。

1.2.5檢測PMN-MDSCs凋亡(Annexin V-APC/7-AAD法) 取“1.2.3”項下allo-HSCT術后患者PMN-MDSCs于室溫2 000 r/min離心5 min,用預冷1×PBS 1 mL洗滌,2 000 r/min離心5 min;ddH2O稀釋5×Binding Buffer為1×工作液,取1×Binding Buffer 500 μL重懸細胞;5 mL流式試管中加Annexin V-APC 5 μL和7-AAD 10 μL,渦旋混勻,室溫避光孵育5 min;運用BD FACSLyricTMFlow Cytometer進行0 h細胞凋亡檢測及分析,后續按12 h、24 h、48 h時間點對PMN-MDSCs凋亡情況各檢測1次。

1.2.6CFSE染色 96孔U形板每孔加1 mg/L抗CD3/28抗體50 μL,鋁箔包裹96孔板,4 ℃孵育過夜;取出96孔板,吸出殘留的抗體,每孔加完全培養基200 μL,37 ℃的5%CO2培養箱孵育30 min,孵育的同時取“1.2.3”項下allo-HSCT術后患者T細胞于室溫下2 000 r/min離心5 min;用1 mL含有5 μmol/L CFSE染液的 1×PBS緩沖液重懸并染色T細胞,室溫避光孵育5 min;加5倍體積的完全培養基終止反應后于室溫下洗滌T細胞,2 000 r/min離心5 min,重復上述洗滌2遍,重懸T細胞至2.0×109個/L備用;96孔板孵育結束后吸出培養基,根據實驗設計加入不同比例(即T細胞∶PMN-MDSCs=1∶0,1∶1,1∶5,1∶10)CFSE染色完畢的T細胞及“1.2.3”項下allo-HSCT術后患者PMN-MDSCs,置于37 ℃的5%CO2培養箱共培養5 d;共培養的第2天,每孔加10 μg/L IL-7和IL-15增殖培養;共培養結束后收集各孔細胞,置于5 mL流式試管,按照細胞表面標志物染色流程進行抗CD4、CD8及7-AAD染色后流式上機判斷T細胞增殖、分裂情況,采用Flowojo 10.6.2(美國BD Bioscience公司)軟件進行量化比較。

1.2.7ELISpot實驗 35%酒精20 μL/孔加至ELISpot板中,室溫避光孵育1 min;去酒精,每孔中加1×PBS緩沖液200 μL洗滌,重復5次;加抗IFN-γ抗體(1-D1K)100 μL,鋁箔包裹ELISpot板,4 ℃孵育過夜;取出ELISpot板,甩去殘留抗體,每孔加1×PBS緩沖液200 μL 洗滌2遍,加含10% FBS的1×PBS封閉液,常溫避光孵育2 h;甩去封閉液,每孔加1×PBS緩沖液200 μL洗滌5遍;各孔加“1.2.3”項下allo-HSCT術后患者5.0×104個T細胞[實驗組加5.0×104個PMN-MDSCs(即T細胞∶PMN-MDSCs=1∶1),對照組不加入PMN-MDSCs(即T細胞∶PMN-MDSCs=1∶0)],再加刺激物2 mg/L CMV 1 μL、1 mg/L可溶性CD3/28 50 μL(2種刺激物下的各組均設置3個孔),將ELISpot板置于37 ℃的5% CO2培養箱中共培養36 h;甩去細胞,含0.05% Tween20的1×PBS緩沖液20 μL,洗滌5次,每孔加1 mg/L 7-B6-1-biotin 100 μL,室溫避光孵育2 h;含0.05% Tween20的1×PBS緩沖液20 μL,洗滌5次,每孔加1 mg/LHRP 100 μL,室溫避光孵育1 h;含0.05% Tween20的1×PBS緩沖液洗滌4次,1×PBS洗滌1次;每孔加1∶1 000稀釋的AEC 50 μL,室溫下避光孵育5 min,用流動自來水終止反應;采用ELISpot分析儀對各孔IFN-γ分泌情況進行拍照解讀。

2 結果

2.1 PMN-MDSCs形態特征

allo-HSCT術后患者PMN-MDSCs大多呈不成熟粒細胞表型,細胞核占胞質比例大,無明顯分葉;健康供者PMN-MDSCs則呈成熟粒細胞表型,細胞核所占比例小,有明顯分葉。見圖1。

患者 健康供者

2.2 PMN-MDSCs凋亡檢測

allo-HSCT術后患者部分PMN-MDSCs于24 h時出現早期凋亡,48 h時出現晚期凋亡,但大部分PMN-MDSCs于48 h時仍處于存活狀態。見圖2。

圖2 allo-HSCT術后患者PMN-MDSCs不同時間點的凋亡檢測(Annexin V-APC/7-AAD)

2.3 PMN-MDSCs與T淋巴細胞共培養

CFSE染色實驗結果顯示(圖3), allo-HSCT術后患者PMN-MDSCs可抑制由在CD3/CD28單抗偶聯磁珠刺激下所引起的T細胞非特異性增殖,且這種抑制作用(以T細胞分裂指數表示)隨著T細胞與PMN-MDSCs比例的升高而增強。ELISpot檢測結果顯示(圖4),allo-HSCT術后患者PMN-MDSCs可抑制T淋巴細胞在CD3/28或CMV pool刺激下IFN-γ的釋放。

注：A為共培養后熒光圖,B為T細胞分裂曲線圖。

3 討論

研究發現,多形核MDSCs有著粒細胞來源的特性,既不能凍存,也不能使用人外周血淋巴細胞分離液(human lymphocyte separation medium, FICOLL)進行分離[12-13]。鑒于MDSCs的臨床標本不易保存,因此對MDSCs的大量研究尚停留于動物模型階段[9-11,14-15]。目前,圍繞MDSCs并結合 allo-HSCT后病人的臨床預后及轉歸資料進行的探索屈指可數,而針對PMN-MDSCs與allo-HSCT的研究尚比較缺乏。Wang等[11]在動物模型體內圍繞MDSCs所展開的一系列研究發現HLA-DR-/lowCD33+CD16-early-MDSCs對預防人源化小鼠aGvHD能夠起到一定作用;Messmann等[16]在小鼠移植的同時回輸MDSCs,結果表明MDSCs可改善GvHD嚴重程度,并使GvHD 評分從90%下降至30%。T淋巴細胞可分為CD4+輔助T淋巴細胞和CD8+細胞毒性T淋巴細胞[17]。一般認為,在aGvHD中主要發揮作用的是CD8+T淋巴細胞[18-19]。一方面,T淋巴細胞受到抗原刺激后可發生增殖、分化,幼稚的CD4+和CD8+T細胞分化為大量效應細胞,進入外周血并遷移到炎癥組織以對抗感染或腫瘤[20-21];另一方面,T淋巴細胞被抗原激活后立即行使殺傷、釋放細胞因子等功能[22]。前一方面的作用,本研究采用CFSE染色觀察PMN-MDSCs對T淋巴細胞增殖情況的影響,結果表明PMN-MDSCs可抑制由CD3/28非特異性誘導的 CD8+T細胞的增殖,而對CD4+T細胞并無明顯抑制作用;后一方面的作用,本研究使用ELISpot進行評價,結果亦表明,PMN-MDSCs可同時抑制由CD3/28非特異性誘導及CMV pool特異性誘導的T淋巴細胞內細胞因子的釋放。總之,上述結果可以說明PMN-MDSCs具有免疫抑制功能,這和廣泛的動物研究結果認為MDSCs具有免疫抑制功能相符合[8,11]。

綜上所述,本研究表明PMN-MDSCs具有抑制allo-HSCT術后患者自身T淋巴細胞增殖及激活的功能。因此,可以預見PMN-MDSCs在患者移植后早期可能降低了aGvHD發生率,并且緩解了aGvHD嚴重程度。這也就使得PMN-MDSCs在臨床工作中作為aGvHD防治策略成為可能。