雙歧桿菌、韋榮球菌、奈瑟氏菌生物學特點及其在低齡兒童齲發生發展中的作用和作用機制研究進展

林秀燕，石宏

1 河北醫科大學口腔醫學院，石家莊 050017；2 河北醫科大學口腔醫院兒童口腔科；3 河北省口腔醫學重點實驗室；3 河北省口腔疾病臨床醫學研究中心

低齡兒童齲（Early childhood caries，ECC）是臨床最常見的兒童口腔疾病，其患病率高居兒童疾病的首位，是患病率第2 位的哮喘病的5 倍［1］。ECC 可導致兒童乳牙缺損、根尖周炎、乳牙滯留，影響恒牙的正常替換，嚴重者可引起全身其他器官的感染與損害，對兒童的身心健康造成極大危害。ECC 的發生發展可能與細菌、宿主、飲食等因素密切相關，口腔微生物群落的存在和生態失調可能在ECC 的發生發展中具有重要作用［2］。既往研究［3］認為，變形鏈球菌是齲病的主要致齲菌之一，在重度低齡兒童齲（Severe early childhood caries，SECC）的發生發展中發揮重要作用。然而基于傳統致病菌的治療未能有效降低齲病的發生率，可見以變形鏈球菌為主的單一致病菌理論無法完全反映口腔微生物在ECC 發生發展中的作用。最新研究［4］認為，齲齒并不是單純由變形鏈球菌導致的，口腔微生物群落的整體平衡的改變導致齲齒的發生。有學者認為雙歧桿菌、韋榮球菌及耐瑟氏菌是益生菌，可維持人體口腔健康；但部分學者認為，雙歧桿菌、韋榮球菌及耐瑟氏菌具有一定致齲性，與ECC 的發生發展有關。目前，雙歧桿菌、韋榮球菌及耐瑟氏菌在ECC 發生發展中的作用及作用機制已有部分研究報道。 現將雙歧桿菌，韋榮球菌、耐瑟氏菌的生物學特點及其在ECC 發生發展中的作用及作用機制研究進展進行綜述。

1 雙歧桿菌生物學特點及其在ECC 發生發展中的作用和作用機制

1.1 雙歧桿菌的生物學特點 雙歧桿菌屬［5］是一群具有多形態、無動力的革蘭陽性無芽孢厭氧菌，其最適pH 值為6.5～7.0，最適生長溫度為37～41 ℃，是一種耐酸微生物。該菌屬首先從嬰兒糞便中分離到，生化反應特征為過氧化氫酶陰性，具有Y 形特征，G+C含量高，雙歧桿菌與絕大多數糖類的分解代謝途徑不同，其主要依賴于果糖-6-磷酸解酮酶，而產物不生成二氧化碳、丁酸、丙酸，其主要代謝產物中的乳酸、乙酸以及少量的甲酸的等量比例會隨菌株不同形成差異。雙歧桿菌與腸壁相互作用維護腸道內生理環境，具有調節腸道微生物區系、產生抗菌物質、增強免疫系統等生理功能，被認為是人體益生菌［6-7］。迄今為止，已經分離鑒定的雙歧桿菌（亞種）有88種，多數來自人類腸道和口腔、動物胃腸道［7-8］，比如棲牙雙歧桿菌、齒雙歧桿菌及殊形雙歧桿菌主要在人體口腔中發現。細菌的產酸能力和耐酸性與齲病的發生密切相關，當口腔環境中pH 值小于5.5時，牙釉質開始脫礦。研究發現，雙歧桿菌屬里長雙歧桿菌、動物雙歧桿菌的產酸性最強，芽孢桿菌的產酸能力最低［8］，表明不是所有的雙歧桿菌屬均有強致齲性，不同菌株的致齲性不同，臨床應尋找并阻斷優勢致齲菌株在牙面的定植，抑制ECC的發生發展。

雙歧桿菌的常規鑒定和分類是基于其表型和生化特征，如菌群形態、革蘭氏染色結果、生化反應等。隨著分子生物學的發展，16S rRNA 可以從基因序列中得到不同種系發生水平的多個區域的特定基因信息，目前臨床常用的雙歧桿菌鑒定工具均基于16S rRNA 基因序列分析方法，如ARDRA、DGGE 及物種特異性引物PCR。有研究［9］采用從糞便中進行DNA 的宏基因組測序分析了雙歧桿菌分類群在復雜細菌群落的相關性。納米孔測序技術可用于新的物種鑒定及驗證物種分配的局限性。ANGELL 等［10］使用六聚體頻率和納米孔測序數據的k均值聚類相結合識別了3 個月大嬰兒腸道微生物群中的雙歧桿菌屬及與陰道分娩有關的雙歧桿菌。說明雙歧桿菌屬是較早出現在腸道微生物群落中的，而口腔和腸道微生物之間存在相互作用的關系，腸道的菌群生態的組成和功能失調可能會導致口腔中有害菌的增殖，從而促進ECC 的發生發展。宏基因組霰彈槍方法可根據測序深度提供與特定生態系統相關的復雜微生物群落中存在的微生物的遺傳信息，可識別一些尚未培養的新物種，有學者［11］應用宏基因組霰彈槍測序方法對動物腸道微生物群落中屬于雙歧桿菌屬的新型腸道共生物種進行鑒定。

1.2 雙歧桿菌在ECC 發生發展中的作用及作用機制 研究［12-13］研究了短期食用含乳雙歧桿菌Bb12的益生菌對患齲風險個體唾液中變形鏈球菌計數的影響，結果發現唾液中變形鏈球菌計數顯著降低，說明食用含有乳酸雙歧桿菌Bb12 的益生菌酸奶可能會改變口腔生態環境。但肖小芬等［14］認為，雙歧桿菌屬在SECC 組口腔中的豐度較高，且與齲失補牙面數強正相關，其可能是兒童早期重度齲發生的指示菌屬。有研究［15］采用qPCR 法對75例ECC兒童口腔中的雙歧桿菌、變形鏈球菌、嗜酸乳桿菌等進行量化檢測，發現雙歧桿菌在牙本質齲患兒的口腔牙菌斑中檢出率較高，說明雙歧桿菌在牙本質齲進展中發揮了一定的作用。TANTIKALCHAN 等［16］通過收集122 例泰國2～5 歲無齲及SECC 兒童過夜的牙菌斑進行檢測，發現雙歧桿菌與齲均和牙齦指數相關，但在SECC 兒童牙菌斑中并未檢測到該細菌。這表明雙歧桿菌在ECC 進展中可能并不是最初的定植者之一，其可能具有促進或加速其他細菌在牙面定植及致齲作用。

SANTOS 等［17］發現動物芽孢桿菌和長芽胞桿菌與變形鏈球菌聯合可促進不溶性胞外多糖的產生和齲損的進展，說明不同細菌在ECC 的發生、發展所起的作用不同，菌群之間可能發揮著相互協同或者拮抗的作用。雙歧桿菌具有獨特的代謝途徑，即“雙歧分流”，它可能通過增加產酸性而賦予其致齲潛力。MANOME 等［18］研究結果表明雙歧桿菌能夠在氟化物存在下代謝碳水化合物，在pH 值為7 時其產酸能力與pH 值為5.5 時一樣高，表明雙歧桿菌產酸能力強且具有很高的致齲潛力。通常細菌致齲能力包括它在牙面上的定植能力及其產酸和耐酸能力。雖然多數研究認為，雙歧桿菌可促進ECC 的發生，但由于雙歧桿菌無法在牙面大范圍定植且多在胃腸道黏膜上黏附，及不同菌株之間如何互相作用從而影響ECC 致病程度，其在ECC 發生發展中的具體作用機制仍有待進一步深入研究。而目前生態菌斑學說被大家逐漸接受，其認為致齲微生物可作為口腔常居菌的一部分存在于牙菌斑生物膜中，因此在中性環境下，這些微生物并不在菌群中處于優勢地位，在此生態環境中，牙面的脫礦和再礦化過程處于平衡狀態。那么在雙歧桿菌定植牙面、黏附、繁殖生長、最終在ECC 發生發展的過程中，其他微生物如變形鏈球菌等可能都有不同程度的參與，盡管其產酸能力可能有所差異，但在生態種群的改建中并不存在特異性的選擇。

2 韋榮球菌屬的生物學特點及其在ECC 發生發展中的作用和作用機制

2.1 韋榮球菌的生物學特點 韋榮球菌屬［19］為0.3～0.5 μm 細小直徑的革蘭陰性球菌，呈雙球狀排列、不能運動、無芽孢形成、無莢膜及鞭毛，是絕對的厭氧菌，其作為共生微生物存在于人和動物的口腔、腸道以及生殖泌尿系統和呼吸系統中。韋榮球菌作為牙菌斑形成過程中的早期定植菌之一［20］，其豐度和多樣性在口腔微生物中具有一定的比例，對口腔健康造成了影響。有研究［19］表明在韋榮球菌屬的14 種中，不典型弧菌、牙癬弧菌、小弧菌、羅戈弧菌、散葉弧菌、嬰兒弧菌和托貝蘇氏弧菌已在人類唾液或舌或牙齒生物膜中被發現，它們構成了在齦上、齦下牙菌斑以及口腔粘膜菌群重要組成部分。

韋榮球菌在屬水平上相對容易識別，但在種水平上仍然難以識別，因為沒有有用的表型或生化檢查來區分它們。基于16S rRNA 基因測序的分子方法，包括PCR-RFLP，通常用于鑒定韋榮球菌種水平的菌株，但因為韋榮球菌高度保守的基因序列及其染色體內一致性相對較高，目前較多使用如rpoB、dnak、gltA 等管家基因對其物種進行辨別［21］。MASHIMA 等［22］學者通過采集89例泰國兒童舌部生物膜樣本，使用了一種新的基于rpoB 基因序列的物種特異性引物的一步法PCR 方法進行檢測，這種方法能夠清楚地區分基于DNA-DNA 同源性定義良好但基于16S rDNA定義較差的物種。結果顯示，89例受試者中僅有10 例分離到101 株韋榮球菌屬細菌，對6 種韋榮球菌的rpoB 基因進行相似性搜索，發現所有受試者的rpoB基因在2 500～3 100位具有高度多態性。盡管新證實的這40 個菌株目前已經不能被歸類為任何已經建立的口腔韋榮球菌屬，但說明其他韋榮球菌物種也有可能棲息于口腔環境中。目前也有基于16S 核糖體DNA 基因測序的分子方法，包括PCR 隨機片段長度多態性分析，用來在物種水平上鑒定韋榮球菌菌株［23-24］。然而，關于口腔韋榮球菌的鑒定和分布的研究是有限的，因為該細菌群落可能受到地理位置、年齡、飲食、生活方式、社會經濟地位和口腔衛生狀況差異的影響。

2.2 韋榮球菌在ECC 發生發展中的作用及作用機制 韋榮球菌屬被認為是存在于人類口腔和胃腸道中的共生菌，因為它是核心微生物組的一部分。以往有研究［25］顯示，韋榮球菌因其利用乳酸而非碳水化合物作為能量來源、升高pH的特性以及減少產酸菌的致齲作用被認為是防齲的益生菌。WANG等［26］通過單分子實時測序表征3～5 歲兒童齲齒中的口腔微生物群，結果發現韋榮球菌可能與健康的口腔微生物生態系統有關。但有研究［25］表明，韋榮球菌與變形鏈球菌存在著密切的共生關系。其可能有助于提高變形鏈球菌的群體競爭力，在適當致齲環境存在時，促進微生態向致病性轉化，可能與ECC的發生發展存在協同作用。可見，韋榮球菌與ECC之間究竟存在何種關系目前尚不清楚，其可能是由于不同細菌物種在ECC 的發展中扮演著不同的角色。以往有研究認為在口腔生物膜形成過程中，韋榮球菌是早期定植菌，但其如何在齲病早期階段發揮致齲作用仍需更深入的研究來了解其具體機制。QUDEIMAT 等［23］采用第二代測序技術對128 例兒童牙菌斑進行測序，結果表明細小韋榮球菌在齲齒活躍的兒童中相對豐度較高并占主導地位。一項為期2 年的縱向研究［27］結果表明，小韋榮球菌可作為ECC 發病風險的生物標志物，其在ECC 發生發展中具有一定的作用。變形鏈球菌作為口腔中常見的致齲菌之一［4］，致齲性取決于其產酸性和耐酸性，能夠迅速發酵多種碳水化合物產生大量酸，使局部pH下降至5.5以下，促進菌斑的形成。LIU等［28］研究表明變形鏈球菌在與韋榮球菌共同培養時，雙菌種生物膜中變形鏈球菌的數量較單獨培養時增加，而在多菌種生物膜中，仍可見韋榮球菌對變形鏈球菌的協同促進作用。韋榮球菌只在有鏈球菌存在時生長，鏈球菌發酵碳水化合物產生的有機酸可作為韋榮球菌的碳源，韋榮球菌不能直接代謝糖類，具有把代謝較強的、非揮發性的乳酸轉化成為較弱的、揮發性的乙酸和丙酸的能力。酸和丙酸的能力。鏈球菌為韋榮球菌提供黏附位點和營養來源，而韋榮球菌可促進鏈球菌生長和生物膜抵抗能力。韋榮球菌作為口腔微生物中高豐度菌屬之一，其高耐酸能力及在牙菌斑形成中的作用，提示韋榮球菌在致齲過程中的地位不可忽視，但其在ECC發生中的機制作用尚不明確。

3 奈瑟氏菌屬生物學特點及其在ECC 發生發展中的作用和作用機制

3.1 奈瑟氏菌的生物學特點 奈瑟氏菌［29］為直徑0.6～1.0 μm 的需氧革蘭陰性球菌，單個或成對排列，且相鄰的一面扁平，按彼此互相垂直的兩個平面分裂，有時導致四聯球菌，不形成內生芽孢，無鞭毛但可有纖毛，不運動，其最適生長溫度為35～37 ℃，對干燥敏感，初次分離需要濕度。口腔奈瑟氏菌需氧酶和過氧化氫酶均為陽性，產生H2S，亞硝酸鹽還原陽性。奈瑟氏菌屬是一類β 變形桿菌，是人和動物的專性共生體，至少有8 種共生奈瑟氏菌在人類黏膜表面定居［30］，人體內發現的奈瑟氏菌有淋球菌、腦膜炎球菌、解乳糖奈瑟氏菌、干燥奈瑟氏菌、微黃奈瑟氏菌、金黃奈瑟氏菌、黏液奈瑟氏菌等，正常人口腔中常見者為干燥奈瑟氏菌、微黃奈瑟氏菌和黏液奈瑟氏菌［29］。其在出生一周的新生兒口腔中無法檢測到，但到八個月后，幾乎所有嬰兒口腔中均能檢測到該菌，7～12 歲兒童中80%唾液內可檢到奈瑟氏菌，為唾液中數量僅次于α—溶血性鏈球菌的細菌，約為5×106/mL。

傳統的奈瑟氏菌表型分類法可鑒別出腦膜炎奈瑟菌、淋球菌和乳鏈球菌，但此方法對于定義和識別其他奈瑟氏菌相關物種具有一定的難度［31］，因此諸如DNA-DNA 雜交和16S 核糖體基因的核苷酸序列數據的系統發育分析等分子方法的應用解決了該問題，基于多基因座序列分析的系統發育，導致了一些奈瑟氏菌屬的重新分類，將其合并為亞黃酮亞變種、全黃菌和黃奈瑟氏菌。也有研究報道可利用16S rRNA 基因的高通量測序和元基因組學來鑒定奈瑟氏菌與齲病相關的潛在屬［32］。

3.2 奈瑟氏菌在ECC 發生發展中的作用及作用機制 奈瑟氏菌為兒童出生后口腔的首批定植者，被證明是來源于健康個體的早期生物膜內細胞-細胞相互作用的重要介質，其可能在維持與健康相關的口腔微生物組中發揮關鍵作用［33］。LEE 等［34］采集120 例韓國12 歲以下兒童的唾液和牙菌斑樣本，用Illumina HiSeq 測序鑒定其口腔細菌組成，結果發現：6 歲以下無齲兒童牙菌斑中口腔奈瑟氏菌含量較高，奈瑟氏菌與ECC 可能并無明顯的相關性。對健康兒童口腔正常菌群的研究也發現，在唾液、菌斑窩溝、齦上菌斑、齦下菌斑中，奈瑟氏菌的檢出率為100%。但XIAO 等［32］學者通過收集96 例3～6 歲無齲、ECC、SECC 兒童的牙菌斑，利用16S rRNA 基因的高通量測序和元基因組學鑒定，表明桿狀奈瑟菌ATCC BAA-1200 菌株在兒童齲病的發生發展過程中起著非常重要的作用，其與齲失補牙面數及葡萄糖相關代謝途徑呈正相關，具有發酵產酸能力。奈瑟氏菌在SECC 兒童唾液微生物群中豐度最高，但也有表明低齲齒經歷的健康兒童與奈瑟氏菌屬、嗜血桿菌屬和梭桿菌屬的豐度較高有關，而這些屬中的大多數物種僅輕微發酵蔗糖，可見不同的奈瑟氏菌菌株與ECC 的相關性并不完全一致，一些特異性菌株可能具有較強的產酸性和耐酸性，在ECC 的進展中存在潛在的致齲性。

奈瑟氏菌在牙菌斑生物膜中的作用表現為對牙表面黏附能力很弱，但卻是與血鏈球菌一起最早定植于干凈牙面的細菌［35］，其主要存在于菌斑外層和早期菌斑中，可能因為奈瑟氏菌是需氧菌，菌斑早期的高氧壓有利于它生長，而隨著菌斑的成熟，氧壓降低，奈瑟氏菌數量也減少。奈瑟氏菌在分解各種糖時會形成數量不等的酸，其中分解麥芽糖產生的酸最多，且各種奈瑟氏菌產酸的能力也不同，產生酸類最強的是干燥奈瑟氏菌，其次是微黃奈瑟氏菌。干燥奈瑟氏菌在含蔗糖的培養基中產生的多糖莢膜能使無莢膜的細菌聚集，并且這種聚集不因葡聚糖的消化而分解，莢膜還可被其他微生物的生長所利用，促進菌斑形成。微黃奈瑟氏菌中的深黃奈瑟氏菌在含蔗糖的培養基中能產生大量支鏈淀粉，比蔗糖還容易迅速被鏈球菌和乳桿菌所利用。有研究發現腦膜炎奈瑟氏菌可以利用乳酸，從牙菌斑中分離的奈瑟氏菌菌株也已被證明能將乳酸降解為醋酸，表明奈瑟氏菌具有雙向作用，在有蔗糖的條件下可合成胞外多糖并可酵解糖，其具有代謝葡萄糖、產生有機酸的能力，在糖缺少或無糖時，奈瑟氏菌可降解菌斑中產酸菌所產生的乳酸成為弱酸和揮發性酸，其又有利用乳酸的能力［36］。可見奈瑟氏菌在口腔中的扮演的角色是是復雜的，其在低齡兒童致齲過程中所發揮的作用仍然未知，因此未來對奈瑟氏菌的深入研究具有一定的必要性。

綜上所述，ECC 是一種慢性感染性疾病。口腔中部分細菌如雙歧桿菌、韋榮球菌、奈瑟氏菌與ECC的發生發展有關。產酸性較強的雙歧桿菌可導致牙釉質脫礦，促進或加速其他口腔致病菌在牙面的定植，促進ECC 的發生發展。韋榮球菌是牙菌斑形成過程中的早期定植菌之一，促進口腔致病菌變形鏈球菌的生長，提高變形鏈球菌的生物膜抵抗能力，促進ECC 的發生發展。奈瑟氏菌是人體口腔的常見菌，是生物膜內細胞—細胞相互作用間的重要介質，可能通過發酵產酸途徑促進ECC 的發生發展。齲易感兒童非致齲性菌斑轉變為致齲性菌斑的過程中口腔微生物的生理結構、數量種類的變化仍然未知，且細菌酸堿代謝與基于16S 的物種分配的關系似乎也很復雜，但是隨著分子生物學及其技術的不斷發展，在未來的研究中，對整個基因組進行功能描述的元基因組方法、多組學聯合應用等將有助于闡明齲病的微生物發病機制，更好地為ECC 的預防及微生物靶向阻斷提供科學依據。