高產EPS 乳酸菌篩選鑒定、發酵工藝優化及其抑菌活性研究

魏晨佳 馬金璞 郭星晨 楊雪妍 柏家林 高丹丹*

（1西北民族大學生物醫學研究中心，中國—馬來西亞國家聯合實驗室，甘肅蘭州 730030；2西北民族大學生命科學與工程學院，甘肅蘭州 730124）

乳酸菌（lactic acid bacteria，LAB）是可以將糖類分解并產生乳酸的多種細菌的總稱，是公認的食品安全級微生物[1]，在食品、農業、醫藥等領域發揮著重要作用[2]。其在自然界中分布廣泛，種類繁多，人體腸道內含有絕大部分種類的乳酸菌，對腸道免疫系統功能調節和腸道黏膜的保護具有極其重要的作用，是人體重要的菌群之一[3]。乳酸菌被廣泛應用于發酵制品、肉類制品及醫藥保健品等領域[4]。乳酸菌胞外多糖是乳酸菌的主要代謝產物之一，具有良好的物理學特性和生物學活性[5]，多項研究表明，胞外多糖具有抗氧化[6]、免疫調節[7-8]、抑菌[9]、降血糖[10]、抗腫瘤[11]等功能，不僅可以用于功能性食品，還可以作為一種潛在藥物使用[12]。EPS所具有的多種理化特性使其可以作為食品添加劑，用于各種食品中，以達到增稠、穩定、乳化、膠凝及持水的作用[13]，在食品工業中，乳酸菌胞外多糖可用作多種食品的增稠劑、穩定劑、乳化劑和凝膠劑[14]。

乳酸菌胞外多糖作為食品添加劑應用于食品的工業化生產，一方面，提取出的胞外多糖可以就近應用于當地特色酸奶的制作工藝中，改善乳制品的口感風味和品質；另一方面，胞外多糖的抗氧化性、降血糖、抗腫瘤、免疫調節以及其產生的優質生物活性物質，對于功能性食品的開發和研究具有著重要意義。西北地區常用的泡菜原料非常便宜，如白菜、白菜根、蘿卜等，使用甘肅本地特色泡菜，能在一定程度上降低成本。用泡菜水進行乳酸菌胞外多糖的提取，使得泡菜副產物得到更加充分利用。由于泡菜的發酵和儲存過程中經常會出現一些致病菌和雜菌，嚴重制約了泡菜的工業化發展[15]。徐清萍等[16]的研究表明，多種類型的乳酸菌對食源性致病菌具有明顯的抑制效果，這對泡菜的品質和安全生產具有重要意義。因此，本研究通過篩選出高產EPS的乳酸菌菌體，探究其代謝產物對食源性致病菌的抑制作用，以期獲得安全性高的功能性乳酸菌，為發酵制品的加工、儲藏提供理論依據，為泡菜副產物的充分利用提供思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗材料泡菜水：甘肅省蘭州市市售。大腸桿菌、金黃色葡萄球菌：由西北民族大學中國-馬來西亞國家聯合實驗室提供。

1.1.2 培養基MRS固體培養基：蛋白胨10 g、牛肉膏10 g、酵母膏（干粉）5 g、葡萄糖20 g、吐溫-80 1.0 mL、磷酸氫二鉀2.0 g、乙酸鈉5.0 g、檸檬酸氫二銨2.0 g、硫酸鎂0.5 g、硫酸錳0.25 g、瓊脂15 g、蒸餾水1 000 mL，121 ℃滅菌20 min。

MRS液體培養基：在MRS固體培養基的基礎上不添加瓊脂，121 ℃滅菌20 min。

LB 固體培養基：牛肉膏10 g、蛋白胨10 g、瓊脂15 g、NaCl 5 g、蒸餾水1 000 mL、121 ℃滅菌20 min。

LB 液體培養基：在LB 固體培養基的基礎上不添加瓊脂，121 ℃滅菌20 min。

1.1.3 主要試劑牛肉膏、酵母粉、葡萄糖、蔗糖麥芽糖、乳糖（分析純，北京澤平科技有限責任公司）；蛋白胨、大豆蛋白胨、胰蛋白胨、瓊脂（分析純，天津金匯太亞化學試劑有限公司）；吐溫-80（分析純，上海北諾生物科技有限公司）；革蘭氏染液（北京陸橋技術股份有限公司）；硫酸、苯酚、無水乙醇、三氯乙酸、碳酸鈣、氯化鈉、氯化銨、磷酸氫二鉀、乙酸鈉、檸檬酸氫二銨、硫酸鎂、硫酸錳（分析純，國藥集團化學試劑有限公司）。

1.1.4 主要儀器SW-CJ-1F潔凈工作臺（蘇州安泰科技技術有限公司）；50G-YXQLS50G立式壓力蒸汽滅菌器（上海博迅實業有限公司醫療設備廠）；DHG-9146A電熱恒溫鼓風干燥箱（上海精宏實驗設備有限公司）；DNP-9082電熱恒溫培養箱（上海精宏實驗設備有限公司）；ZWYR-2401 恒溫培養震蕩箱（上海智城分析儀器制造有限公司）；KH22R冷凍離心機（湖南凱達科學儀器有限公司）；L3S 紫外分光光度計（上海元析儀器有限公司）；HH-S4A 電熱恒溫水浴鍋（北京科偉永興儀器有限公司）；SG2-FK便攜式pH計（瑞士梅特勒托利多儀器有限公司）；透析袋（北京源葉生物科技有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 產EPS 乳酸菌的分離純化及鑒定（1）產EPS 乳酸菌的篩選 將泡菜水樣品分別接種至MRS液體培養基中，進行擴大培養，十倍梯度稀釋法稀釋后，分別取不同濃度的菌液100 μL涂抹在MRS固體培養基（含2.0% CaCO3）中，37 ℃恒溫培養48 h。乳酸菌在生長過程中產生乳酸，與碳酸鈣反應后可在加有碳酸鈣的平板上形成透明的溶鈣圈，通過此特征篩選出平板上的乳酸菌。對菌株進行擴大培養，十倍稀釋法涂布，37 ℃恒溫培養24 h，挑取具有乳酸菌典型特征的菌落進行反復劃線純化，至菌落形態一致。

（2）菌株形態學觀察 對菌株的純培養物進行革蘭氏染色，在顯微鏡下觀察其細胞形態特征。

1.2.2 乳酸菌胞外多糖的提取與測定采用三氯乙酸法脫蛋白，參考黃承敏[17]的方法并略作修改，取發酵液，5 000 r/min，4 ℃離心10 min，取上清液沸水浴5 min，冷卻至室溫，加80%三氯乙酸至終濃度為8%，攪拌后靜置30 min，5 000 r/min 離心10 min，收集上清液，添加3 倍體積的95%的乙醇，4 ℃靜置過夜，離心，沉淀溶于10 mL蒸餾水，透析2 d，每8 h換1次水，得胞外粗多糖水溶液。

采用苯酚-硫酸法[18]測定多糖含量，在波長490 nm 處測定各反應液的吸光度值，與標準曲線對比，計算多糖含量。

1.2.3 發酵條件的優化以MRS 液體培養基為基礎培養基。接種量2.0%、初始pH 6.0、發酵溫度37 ℃、發酵時間24 h作為初始發酵條件。

（1）單因素試驗設計 選取碳源（葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖）、氮源（普通蛋白胨、大豆蛋白胨、胰蛋白胨、氯化銨）、初始pH（5.0、5.5、6.0、6.5、7.0）、接種量（1.0%、2.0%、3.0%、4.0%、5.0%）、培養時間（24、36、48、60、72 h）5個變量進行單因素試驗，按照1.2.2 的方法提取多糖并測定菌株胞外多糖產量。以胞外多糖的產量為指標，確定最佳碳源、氮源、初始pH、接種量和培養時間。每組試驗重復3 次，最終結果取平均值。

（2）正交試驗設計 用軟件IBM SPSS Statistics 25設計正交試驗，以初始pH、接種量、培養時間作為變量，進行3 因素3 水平L9（33）正交試驗，測定不同發酵條件下產生的乳酸菌胞外多糖產量，確定各因素對結果的影響大小，并篩選出最佳發酵參數，試驗設計見表1。

表1 正交試驗因素水平設計

1.2.4 抑菌活性的測定以金黃色葡萄球菌和大腸桿菌為指示菌，用瓊脂平板擴散法分別測定菌體及發酵產物的抑菌活性，每組試驗重復3次，觀察乳酸菌發酵產物的抑菌效果，測量不同指示菌的抑菌圈大小。

1.2.5 數據分析采用IBM SPSS Statistics 25軟件進行正交設計、數據分析，運用Origin 8.6、Excel 2016進行圖像制作。每組試驗重復3 次，數值以“平均值±標準偏差”表示。

2 結果與分析

2.1 乳酸菌的分離純化和形態學觀察

將乳酸菌菌株接種在MRS 固體培養基37 ℃培養48 h后，培養基中出現明顯的碳酸鈣溶解圈如圖1 所示，挑選單一菌落進行培養，菌落形態如表2 所示。乳酸菌菌落形態：菌落呈圓形，乳白色不透明，濕潤，邊緣整齊。革蘭氏染色如圖2 所示，6 株菌均為革蘭氏陽性菌，菌株XBMU436-003 呈球狀，綜合圖3所示，球菌EPS產量較少，其余5株菌株呈短桿狀，EPS 產量均比球菌高。相較于球菌，桿菌EPS 的產量更高。

圖1 培養基菌落

圖2 菌株鏡檢

圖3 不同菌株EPS含量

表2 乳酸菌菌落形態描述

2.2 乳酸菌產EPS含量測定

產EPS 的菌株篩選結果如圖3 所示，得到6 株EPS 產量較高的乳酸菌，分別命名為XBMU-001、XBMU-002、XBMU-003、XBMU-004、XBMU-005、XBMU-006，根據葡萄糖標準曲線回歸方程：Y=0.743 4X+0.007，r2=0.999 4，得出不同乳酸菌產EPS 有明顯差異，其中菌株XBMU-002 的EPS 產量最高，為156.92 mg/kg，菌株XBMU-003 的EPS 產量最低，為82.78 mg/kg，其余4株乳酸菌的EPS含量基本維持在107~132 mg/kg，因此XBMU-002屬于高產胞外多糖的乳酸菌。

2.3 單因素試驗

2.3.1 碳源對乳酸菌發酵中胞外多糖產量的影響碳源不僅可以為微生物的生長提供重要的碳素來源和能量來源，而且不同種類的碳源對微生物EPS的產量具有顯著差異。如圖4 所示，選擇4 種不同種類的碳源作為培養基的唯一碳源時，XBMU-002胞外多糖產量依次是麥芽糖>蔗糖>葡萄糖>乳糖。可見當乳糖作為唯一碳源時，EPS 產量相對較差，菌株EPS 產量僅有82.47 mg/kg，Fazilet 等[19]研究發現，添加乳糖的MRS 液體培養基對EPS 的產生具有一定的抑制作用。以麥芽糖作為唯一碳源時，EPS產量最高，研究發現，葡萄糖為碳源時更多的糖底物流向了菌體的合成，促進了菌體的生長代謝，高濃度的葡萄糖則會抑制菌體的呼吸代謝和多糖的合成速率。麥芽糖為碳源時更多的底物葡萄糖流向多糖的合成，更有利于菌體的呼吸代謝，極大地促進了碳源消耗速率和產物合成速率。因此，麥芽糖為乳酸菌XBMU-002 最佳碳源，有利于EPS 生物合成。

圖4 不同碳源條件下XBMU-002菌株EPS含量

2.3.2 氮源對乳酸菌發酵中胞外多糖產量的影響氮源是乳酸菌生長過程的重要營養物質，不同氮源中的營養成分影響胞外多糖合成途徑中相關酶的活性，從而影響胞外多糖的產量。因此，不同種類的氮源對微生物EPS的產量具有顯著差異。由圖5可知，使用胰蛋白胨培養基EPS產量為100.38 mg/kg，氯化銨培養基EPS產量最低，僅為86.15 mg/kg，普通蛋白胨作為唯一氮源時胞外多糖產量為108.02 mg/kg，以大豆蛋白胨作為唯一氮源時的產量為125.24 mg/kg，與普通蛋白胨相比提高了16%，研究發現大豆蛋白胨通過水解或酶解等手段分解獲得小分子肽、氨基酸等微生物生長必需的物質，從而促進乳酸菌、酵母菌的生長發育。因此，大豆蛋白胨為乳酸菌XBMU-002產EPS的最佳氮源。

圖5 不同氮源條件下XBMU-002菌株EPS含量

2.3.3 接種量對乳酸菌發酵中胞外多糖產量的影響合適的接種量在節省發酵時間和成本的基礎上，還可以提高EPS的合成量，不同乳酸菌EPS的最適生物合成條件差異較大，往往需要通過試驗測得最佳接種量。如圖6 所示，當接種量處于較低水平（1.0%~2.0%）時，EPS的合成量隨接種量的增加而增加，接種量為2.0%時XBMU-002胞外多糖產量達到峰值，進一步加大接種量發現EPS 產量開始緩慢降低，可能因為接種量過大時將會導致溶解氧快速耗盡，從而抑制菌株的快速生長與代謝產物的生成[20]，也可能是由于接種量的增大，使培養基中的乳酸菌之間產生生長競爭，培養基環境條件惡化，使EPS的產量隨著乳酸菌群體生長下降而降低。因此，選擇對多糖積累效果最佳的接種量2.0%為最適接種量。

圖6 不同接種量下XBMU-002菌株EPS含量

2.3.4 pH對乳酸菌發酵中胞外多糖產量的影響培養基的起始pH以及在培養過程中對pH的控制，都會影響胞外多糖的最終產量。關于pH對微生物EPS生產量的影響，已經證實異戊二烯脂運載活性的最適pH為6.5~7.0，pH降低會使多糖的合成因失去脂中間體而受阻。培養基初始pH 會影響乳酸菌生物合成EPS，使用不同初始pH的培養基，37 ℃搖瓶培養，測定EPS產量。結果如圖7所示，隨著初始pH的上升，乳酸菌XBMU436-002 胞外多糖產量呈先上升后下降的趨勢，在初始pH為6.5時，EPS產量達到最高，過高或者過低的pH都不利于菌體產生胞外多糖，在代謝過程中，乳酸菌會產生大量乳酸及酶類，隨著這些物質的積累，從而使得培養基pH降低，不利于菌體生長，并且使多糖的合成因子脂中間體減少，降低了EPS 合成，同時分泌的酶類對胞外多糖有降解的作用。相較于中性環境，菌體處于弱酸環境中更有利于菌體的生長和EPS的累積。因此，選擇pH 6.5作為菌株XBMU436-002產EPS的最適初始pH。

圖7 不同初始pH條件下XBMU-002菌株EPS含量

2.3.5 培養時間對乳酸菌發酵中胞外多糖產量的影響發酵時間對乳酸菌XBMU436-002 產胞外多糖的影響結果如圖8 所示。在發酵初期，菌種XBMU436-002 的EPS 的產量隨著培養時間的延長而增加，并在發酵48 h 時，EPS 產量達到最大值121.83 mg/kg。進一步延長培養時間后發現，EPS含量開始降低。產生這種結果的原因可能有2 種：（1）乳酸菌發酵過程中積累的有機酸對EPS 產生的降解作用；（2）菌體為應對發酵后期碳源匱乏的環境而降解EPS。鑒于EPS 產量最大值出現在48 h，因此，選取該時間點作為最適培養時間。

圖8 不同發酵時間下XBMU-002菌株EPS含量

2.4 正交試驗

選取培養基初始pH、培養時間、接種量進行3因素3水平L9（33）正交試驗，測定不同發酵條件下的乳酸菌胞外多糖產量，確定各因素對結果的影響大小，并篩選出最佳發酵參數，正交試驗分析如表3所示。結果表明，影響發酵的各因素主次關系為B>A>C，培養基培養時間長短影響最大，其次是培養基初始pH，接種量極差最小。根據正交試驗結果，得出最優發酵條件組合為A2B3C1，即培養基初始pH 為6.0，培養時間為60 h，接種量2.0%。

表3 正交試驗結果與分析

以最佳條件進行驗證試驗，培養基初始pH 6.0，接種量2.0%，選用麥芽糖作為碳源，大豆蛋白胨作為氮源，發酵時間為60 h，發酵溫度為37 ℃，平行試驗3 次，優化發酵工藝后的乳酸菌胞外多糖的產量為199.70 mg/kg，產量比優化前提高36.16%。

2.5 抑菌活性的測定

由表4和圖9可知，生理鹽水（對照組）對2株指示菌的生長無明顯抑制作用。乳酸菌XBMU-002發酵產物和菌體對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌均有抑制作用，其中菌株XBMU436-002發酵產物對金黃色葡萄球菌的抑制效果一般，對大腸桿菌有較強的抑制作用，抑菌圈直徑可達（20.67±2.87）mm，分析原因可能是乳酸菌發酵液中含有許多酸類物質（乳酸、乙酸、丙酸等），pH較低，造成不利于大腸桿菌生長的環境。菌株XBMU436-002 菌體對金黃色葡萄球菌具有較強的抑制效果，抑菌圈直徑可達（16.67±2.36）mm，可能是乳酸菌作為優勢菌群快速生長，競爭營養物質，從而抑制金黃色葡萄球菌生長。綜合上述結果可得出菌株XBMU436-002 對食源性致病菌具有明顯的抑制效果，具有潛在的開發與應用前景。

圖9 高產EPS乳酸菌產物和菌體的抑菌效果

表4 高產EPS乳酸菌的抑菌活性

3 結論

從甘肅省蘭州市市售泡菜中篩選出1株高產胞外多糖的乳酸菌，編號為XBMU436-002。為了獲得最佳發酵條件，以發酵培養基中胞外多糖的含量為試驗指標，采用單因素試驗的方法，分別確定出最佳碳源、氮源、接種量、初始pH 和培養時間，確定以麥芽糖作為碳源，大豆蛋白胨作為氮源，通過3 因素3 水平L9（33）正交試驗（培養時間、初始pH、接種量）優化培養基得出最佳培養基條件為初始pH 6.0，接種量2.0%，發酵時間60 h，在最佳條件下，胞外多糖產量高達199.70 mg/kg。體外抑菌試驗表明，XBMU436-002發酵產物及菌體對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌具有明顯的抑制作用。本研究可為泡菜副產物的充分利用提供新思路，為高產胞外多糖乳酸菌其他方面的應用提供研究依據。