三種外源物質對鎘脅迫下紫花苜蓿種子萌發的影響

凌立貞, 李常榮, 張書東

(六盤水師范學院生物科學與技術學院, 貴州 六盤水 553004)

隨著農藥和化肥在我國農業生產過程中的大量使用,農用耕地污染問題日趨嚴重。2014年《全國土壤污染狀況調查公報》[1]公布的我國農用耕地土壤污染點位超標率為19.4%,其中輕度、中度和重度污染點位比例分別為2.8%,1.8%和1.1%,而重金屬是其主要污染物,如鎘(Cd)、鎳(Ni)、銅(Cu)、砷(As)、汞(Hg)、鉛(Pb)等。據不完全統計,我國每年因重金屬污染的糧食高達1 200萬t,造成了巨大的經濟損失和糧食浪費[2-3]。除人為因素造成的土壤重金屬污染外,重金屬元素還可通過巖石風化、森林大火和火山爆發釋放等自然現象進入環境[4],從而加劇土壤的污染狀況。

在我國,Cd污染點位超標率達7%,Cd已經成為我國耕地土壤最嚴重的重金屬污染物。據報道我國農田重金屬Cd污染面積已達2×104hm2,每年有14.6×108kg農產品Cd含量超標,且有日益增加的趨勢[5]。Cd不是植物生長的必需元素,Cd含量過高會導致植物生長緩慢,光合系統、氣孔運動、酶活性、蛋白質代謝和膜功能發生異常變化,從而造成葉綠體結構破壞,激化葉綠素分解,阻斷營養元素向上運輸等危害[6]。此外,土壤中的Cd容易被植物吸收積累,并通過食物鏈進入人體,從而危害人類的身體健康[7-8]。Cd超標能夠引起肝臟、腎臟、骨骼、生殖、呼吸系統等方面的損害,居住在Cd污染區的人們患上述疾病的風險性更高[9]。為減少土壤中Cd元素對植物和人體的傷害,研究人員研發出了多種土壤修復技術,部分取得明顯成效并在實踐中得以應用。目前,生物修復技術因具有操作簡單、成本低、無二次污染等優點被廣泛應用于修復重金屬Cd等污染的土壤[10-11]。在此修復方式中尋找最佳超富集植物是實施土壤修復的關鍵。紫花苜蓿(Medicagosativa)為豆科苜蓿屬多年生草本植物,可以在缺少營養、鹽堿、干旱等不良環境條件下生長[12],是廣泛種植的牧草作物,其發達根系上的根瘤具有固氮作用,還可以提高土壤肥力。紫花苜蓿對Cd、Zn、Cu及Ni等多種重金屬元素具有較高的富集功能,在重金屬污染土壤的生態修復中起著極為重要的作用[13-14]。

種子萌發是植物生長起始的重要階段,對環境變化感應非常敏感。多項研究表明,低濃度Cd脅迫對植物種子的萌發沒有明顯的抑制效果,有的甚至提高了種子的發芽率、發芽勢、發芽指數等指標,而中高濃度的Cd處理會明顯降低植物種子的萌發指標。如田丹等[15]研究表明,低濃度的Cd處理(1 mg/L)對生菜的萌發無明顯影響,當Cd濃度高于10 mg/L時明顯降低生菜種子的萌發指標。因此,多數情況下研究人員會把種子萌發階段作為植物耐Cd性評價的關鍵階段。此外,一些研究發現,通過施加外源物質可以減輕Cd對植物的毒害作用。如施加外源檸檬酸(CA)能有效緩解Cd脅迫對植物生長的抑制,減少活性氧的含量而增加抗性物質的含量[16];施加外源3-吲哚乙酸(IAA)能促進葉綠素a和葉綠素b的合成,增大光合作用強度和提高抗氧化酶的活性來緩解Cd對植物的毒害作用[17];適當濃度的水楊酸(SA)處理萵苣種子可以緩解Cd對其種子萌發和幼苗生長的傷害[18]。

為加大紫花苜蓿在Cd污染土壤修復中的應用,本研究以高產型維多利亞紫花苜蓿為研究材料,通過在明顯開始抑制紫花苜蓿種子萌發的Cd濃度下施加三種外源物質CA、SA和IAA,檢測施加不同外源物質對Cd脅迫下紫花苜蓿種子萌發的影響。這些研究結果將對于紫花苜蓿緩解Cd2+的毒害作用和在重金屬Cd污染土壤開展修復改良工作具有重要意義,同時,也為其他重金屬富集植物的研究提供借鑒作用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1材 料

本試驗所使用的紫花苜蓿品種為維多利亞,種子購買于藍天種子公司。

1.1.2主要藥品試劑

氯化鎘(CdCl2)、無水乙醇(C2H6O)、檸檬酸(CA)、3-吲哚乙酸(IAA)、水楊酸(SA)。

1.2 實驗方法

1.2.1抑制紫花苜蓿種子萌發的Cd濃度檢測

挑選飽滿程度一致,無蟲害和不破損的種子,用5%的次氯酸鈉溶液浸泡20 min進行消毒后,用蒸餾水沖洗3～5遍,再用75%的酒精消毒5 s后,用蒸餾水沖洗3遍。用濾紙把種子上的水吸干備用。

在培養皿(直徑9 cm)中鋪墊2層濾紙,取100粒消毒后紫花苜蓿種子放置在培養皿中,加入等量不同濃度的CdCl2溶液,溶液以浸濕濾紙為宜,每個濃度處理3個重復。將培養皿放于25 ℃光照培養箱中培養,每天觀察記錄種子發芽數(按胚根與種子等長/胚芽長度達到種子長的一半為發芽標準),持續10 d后結束。在種子培養到第4天的時候,計算種子的發芽勢,在種子培養第10天完成時,計算種子的發芽率、發芽指數和活力指數,并精確測量其芽長、根長(單位cm,保留小數點后兩位)。共設置6個濃度梯度(5,10,20,50,100,200 mg/L)的CdCl2溶液處理紫花苜蓿種子,以無菌水處理作為對照。通過以上種子萌發指標的比較,篩選出明顯抑制紫花苜蓿種子萌發的CdCl2溶液濃度。

1.2.2外源物質緩解Cd脅迫下紫花苜蓿萌發情況

實驗所用的3種外源物質分別為水楊酸(SA)、3-吲哚乙酸(IAA)及檸檬酸(CA)。SA溶液濃度梯度設置為50,100,200,400 μmol/L;IAA濃度配制為10,25,50,100 μmol/L;CA濃度設置為1,2,4,8 mmol/L。

將紫花苜蓿種子用上述濃度的CA、IAA和SA溶液浸種4 h,浸種完成后用蒸餾水反復沖洗種子并用濾紙吸干表面水分。將種子均勻整齊地鋪在有兩層濾紙的培養皿里,每皿50粒種子,每個處理3個重復。根據1.2.1試驗結果在每個培養皿中加入100 mg/L CdCl2溶液。將處理好的種子放在溫度為25 ℃的光照培養箱中進行培養。每天觀察記錄種子發芽數,最終統計發芽率、發芽勢、發芽指數和活力指數等指標。

1.3 發芽指標的計算

發芽率/%=(總的發芽種子數/供試種子數)×100%;

發芽勢/%=(第4天時種子發芽數/供試種子數)×100%;

發芽指數(Gi)=∑(Gt/Dt),

式中:Gt表示第t天的種子發芽數,Dt表示對應種子的發芽天數。

活力指數(Vi)=Gi×S=∑(Gt/Dt)×S,

式中:Gi表示發芽指數,S表示紫花苜蓿幼苗芽長,單位cm(保留小數點后兩位)。

1.4 數據處理與分析

數據采用SPSS19軟件進行單因素方差分析及差異顯著性檢驗,并采用Microsoft Office2016軟件進行數據處理及圖表繪制。

2 結果與分析

2.1 Cd對紫花苜蓿種子萌發的影響

本研究用6個濃度梯度的CdCl2處理維多利亞紫花苜蓿,觀察其對Cd的耐受情況。由圖1可以看出,隨著CdCl2濃度的逐漸增加,紫花苜蓿種子的4個萌發指標(發芽率、發芽勢、發芽指數和活力指數)均呈下降趨勢。但是這4個萌發指標與對照組比較,呈顯著下降時的CdCl2溶液濃度并不完全相同。紫花苜蓿在CdCl2濃度為100 mg/L時發芽率為74.67%,與對照(94.00%)相比差異顯著(p<0.05)(圖1 a);而在200 mg/L時,紫花苜蓿的種子萌發才受到嚴重限制,僅有23.67%的種子萌發(圖1a)。發芽勢與發芽率具有相似的下降趨勢,但在CdCl2濃度為50 mg/L時與對照相比已經出現了顯著性差異(圖1 b)。發芽指數和活力指數的變化趨勢基本一致,分別在CdCl2濃度為5 mg/L和20 mg/L時出現了小幅度的回升,但是發芽指數在這些CdCl2濃度下與對照均沒有明顯差異,當CdCl2濃度上升到50 mg/L時,與對照相比差異顯著(圖1 c)。就活力指數而言,在低濃度(10 mg/L)時出現顯著下降,而在高濃度(200 mg/L)的CdCl2溶液脅迫下活力指數幾乎為0(圖1 d)。基于以上結果可知,Cd對紫花苜蓿種子萌發隨著濃度的增加,抑制程度也增加。綜合4個萌發指標,選定100 mg/L的CdCl2溶液作為后續的緩解Cd脅迫實驗用濃度。

注:A為萌發率;B為發芽勢;C為發芽指數;D為活力指數。圖1 鎘對紫花苜蓿種子4種萌發指標的影響

2.2 外源物質對Cd脅迫下紫花苜蓿種子萌發的影響

由表1可以看出,100 mg/L CdCl2溶液對紫花苜蓿種子的脅迫作用在外施三種外源物質后均出現了不同程度的緩解。在CA處理后,隨著浸種CA濃度的升高,Cd脅迫下的紫花苜蓿種子發芽率和發芽指數均有所升高,但是與單獨的Cd處理相比均無明顯差異;發芽勢和活力指數兩個萌發指標都呈現出先上升后下降的趨勢,但是在施加中低濃度(<4 mmol/L)的CA后均出現了顯著性上升(表1)。SA浸泡紫花苜蓿種子后,Cd脅迫下發芽率和發芽指數均沒有明顯的變化;而發芽勢和活力指數在分別施加10 μmg/L和25 μmg/L的SA后顯著增加(表1)。但與CA不同的是,外源施加SA后各項指標均呈上升的變化趨勢。不同濃度IAA浸種后,在100 mg/L Cd脅迫下紫花苜蓿種子各項萌發指標均表現出先增后降的變化趨勢。這種趨勢與施加外源的CA是相同的。在4個萌發指標中,除了發芽指數外其他3個萌發指標(發芽率、發芽勢和活力指數)均在施加外源的IAA后有所上升,且與對照相比都出現顯著性增加(p<0.05)(表1)。由此可知,這三種外源物質浸種紫花苜蓿種子均有緩解Cd脅迫的作用。

表1 施加外源CA、IAA和SA對Cd脅迫紫花苜蓿種子萌發的影響

3 討 論

紫花苜蓿是一種廣泛種植的牧草,對Cd具有一定的耐受性[19]。但是,不同的紫花苜蓿品種對Cd脅迫的耐受性存在較大的差異,如阿爾岡金紫花苜蓿在低濃度(5 mg/L)Cd脅迫下種子的萌發就受到了明顯的抑制[20],與本試驗結果顯示的維多利亞紫花苜蓿在較高濃度(100 mg/L)Cd脅迫下種子4個萌發指標產生了明顯下降,存在較大的差異。為深入研究施加外源物質對Cd脅迫的緩解作用,本研究采用了100 mg/L的CdCl2溶液作為脅迫濃度開展試驗。種子萌發是植物感應外界環境的初始階段,是植物生活史的一個重要組成部分。在遭受重金屬脅迫時,其種子萌發指標:發芽率、發芽勢、發芽指數、活力指數等會產生相應的變化。本試驗采用三種外源物質(IAA,CA和SA)處理紫花苜蓿種子后,這4個萌發指標反應的敏感性不同。發芽率只有在紫花苜蓿種子施加外源IAA時對Cd脅迫才有緩解作用,CA和SA即使在高濃度時對發芽率的緩解效果也不明顯(表1)。而發芽勢是最敏感的一個萌發指標,在三種外源物質浸種后都表現出了顯著上升,其中施加IAA和CA后都達到了無Cd脅迫時的水平(91%),而施加SA后紫花苜蓿種子的發芽勢盡管一直處于上升的趨勢,但是在本試驗所用的濃度下最高達到了88%(表1),不及無Cd脅迫時的水平。發芽指數是最不敏感的一個萌發指標,不管是外源物質的種類還是濃度的高低均沒有影響這個指標。活力指標與發芽勢相似,對三種外源物質的施加非常敏感,除低濃度的SA(10 μmg/L)外,其他濃度的SA、CA和IAA都對Cd脅迫下的紫花苜蓿種子脅迫作用有顯著的緩解效果。因此,這些分析表明本實驗中發芽指數不適用于作為指示外源物質緩解Cd毒害作用的一個生理指標。

施用外源物質能夠有效地控制Cd污染對農作物的毒害作用。其中,這些外源物質種類比較多,主要包括致酸性外源物質、土壤改良劑、稀土元素和微生物等[21]。本試驗發現施加三種致酸性外源物質(CA、IAA和SA)對紫花苜蓿種子的Cd毒害都有明顯的緩解效果。前期研究表明CA、IAA和SA能夠緩解多種植物的Cd毒害作用。如,外施SA能夠顯著緩解Cd對小報春和孔雀草幼苗的毒害作用[22-23]。同樣地,在栝樓葉片上噴施IAA溶液或者在用CA處理綿毛水蘇、披堿草、小白菜、龍葵、棉花等都能緩解Cd脅迫的影響[16-17,24-25]。這些外源物質基本上都是通過調節植物的抗氧化系統和光合系統來增強植物的抗性或者是通過抑制Cd在植物體內的吸收和轉運等方式來緩解Cd的毒害作用[22]。本試驗中這三種外源物質對維多利亞紫花苜蓿品種受到Cd毒害的緩解機制還需要進一步的研究。

4 結 論

綜上所述,Cd脅迫對維多利亞紫花苜蓿的種子萌發產生明顯的抑制作用,尤其是在濃度100 mg/L以上時4個萌發指標(萌發率、發芽勢、發芽指數和活力指數)均顯著下降。為減輕Cd脅迫作用,利用三種外源物質(CA、SA和IAA)處理100 mg/L CdCl2脅迫維多利亞種子,發現這三種外源物質均能產生有效的緩解作用。其中發芽指數在這三個外源物質處理后均無明顯變化。因此,在本試驗中發芽指數不適合作為檢測Cd毒害緩解效果的一種生理指標。