油茶炭疽病復合病菌鑒定及室內藥劑評價*

李玲玲 朱原野 張盛培 李 河

（南方人工林病蟲害防控國家林草局重點實驗室 森林有害生物防控湖南省重點實驗室 森林生物資源與有害生物綜合管理湖南省普通高等學校重點實驗室 中南林業科技大學 長沙 410004）

油茶（Camellia oleifera）是我國特有的木本食用油料樹種，主要種植于我國南方14 個省（市、自治區），至今已有兩千多年的栽培歷史（陳永忠等, 2013）。近年來，我國油茶種植面積持續增加，油茶籽產量不斷提高，截至2019 年全國油茶種植面積達到453.3 萬hm2，油茶籽產量達267.9 萬t。油茶產業的高質量發展對維護我國糧油安全、推動農村經濟發展，鞏固油茶產區農民脫貧致富成果具有重要作用（張立偉等,2021）。但隨著油茶種植面積的迅速增加，各類油茶病害的發生也日趨嚴重，其中油茶炭疽病是危害油茶最嚴重的病害之一，嚴重阻礙了油茶產業的健康發展。目前已報道的油茶炭疽病的病原菌主要有：膠胞炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides）、果生炭疽菌（C.fructicola）、暹羅炭疽菌（C. siamense）、山茶炭疽菌（C.camelliae）、喀斯特炭疽菌（C. karstii）、博寧炭疽菌（C.boninense）、（C. henanense）、哈銳炭疽菌（C. horri,C.nymphaeae）（Liet al., 2018；李河等, 2015；2017；Liet al., 2020）。

復合侵染是指2 種或2 種以上的病原物共同侵染寄主植物引起病害的現象。目前研究表明，在馬鈴薯（Solanum tuberosum）、蠶豆（Vicia faba）、甜瓜（Cucumis melo）、玉米（Zea mays），番茄（Lycopersicon esculentum）等多種植物中存在由病原物復合侵染引起的病害，Li 等（2021）研究表明，番茄褪綠病毒（ToCV）和番茄黃化曲葉病毒（TYLCV）復合侵染番茄時具有協同增效作用，導致番茄病害嚴重度指數高，莖高和莖重降低。錢恒偉等（2017）研究發現甘薯莖枯病是由尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）和細極鏈格孢（Alternaria tenuissima）復合侵染引起的。吳會杰等（2021）研究報道黑點根腐病菌（Monosporascus cannonballus）和鐮孢菌（Fusarium oxysporumf.sp.melonis）復合侵染引起甜瓜根腐病。實驗室前期研究發現，在分離油茶炭疽病病原菌的過程中，除炭疽屬之外，總能分離出擬盤多毛孢屬（Pestalotiopsissp.）和鏈格孢屬（Alternariasp.）真菌。進一步致病性測定結果表明，擬盤多毛孢屬和鏈格孢屬真菌都是油茶的致病菌。由此筆者推測，油茶炭疽病可能存在炭疽菌和其他致病菌復合侵染現象。

油茶炭疽病的防治措施主要是化學防治。曹志華等（2012）發現10%苯醚甲環唑WG 對油茶炭疽病病原菌的室內毒力最強；陳紹紅等（2007）室內和田間試驗表明，撲菌清、葉斑凈和寶寧對油茶炭疽病的防治效果較好；王義勛等（2014）田間試驗結果表明，40%氟硅唑乳油2 000 倍液或10%苯醚甲環唑水分散粒劑4 500 倍液對油茶炭疽病的防治效果較好。但是，一種殺菌劑對不同屬甚至同屬不同種病原菌的抑制活性存在較大差異，如氟吡菌酰胺對牡丹炭疽病菌的抑制作用較好，但對辣椒炭疽病菌則沒有抑制作用（徐娜娜等，2021；高楊楊，2021）；代森錳鋅對鏈格孢（Alternaria alternata）具有抑制作用，但對炭疽病菌（C.gloeosporioides）和新擬盤多毛孢（Neopestalotiopsis clavispora）幾乎沒有抑制作用（馮寶珍等，2019；曹志華等，2012；溫浩等，2019）。前期研究發現油茶炭疽病斑中除炭疽菌以外，可能還存在其他致病菌，防治多種病菌復合侵染的油茶炭疽病目前尚無相關研究報道，為了有效防治油茶炭疽病，亟需篩選能同時殺死或抑制病斑中多種致病菌的殺菌劑。

本研究采用組織分離法對油茶炭疽病復合病菌進行分離，結合形態學和分子生物學進行種類鑒定，通過復合侵染試驗探究致病菌之間的關系，并對致病力強的復合病菌進行室內藥劑篩選，以期為全面合理有效的防治油茶炭疽病提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 病樣的采集與菌株分離

油茶炭疽病病葉于2020 年6—10 月采集自湖南長沙、瀏陽、益陽、湘潭、廣西南寧、廣東東莞，海南澄邁及江蘇南京8 個地區的油茶成林。采用Cai 等（2009）組織分離法分離病原菌，由本實驗室保存。

1.2 培養基及供試藥劑

供試培養基：PDA 培養基；AEA 培養基。

供試藥劑：96%咪鮮胺原藥、95%苯醚甲環唑原藥、98%啶酰菌胺原藥、96%氟吡菌酰胺原藥，98%嘧菌酯原藥，97%啶氧菌酯原藥，均由濟南一農化工有限公司提供。99%水楊肟酸（SHAM）為美國Sigma公司產品。

1.3 柯赫氏法則驗證

采用李河等（2017）、Maharachchikumbura 等（2016）和Woudenberg 等（2013）的方法對分離獲得的油茶病原真菌進行形態學鑒定和柯赫氏法則驗證，確定油茶炭疽病斑中的致病菌種類。

1.4 分子生物學分析

采用CTAB 法（Xuet al., 1996）提取致病菌基因組DNA，-20 ℃保存備用。利用通用引物ITS1/ITS4（序列見表1）對所有致病菌的ITS 序列進行PCR 擴增，擴增產物由北京擎科生物科技有限公司進行測序。將獲得的序列在NCBI 中進行BLAST 比對，初步分析致病菌種類，進一步用特異性基因擴增測序。炭疽菌屬菌株由ITS 和ApMat基因序列聯合構建系統發育樹進行分析，擬盤多毛孢屬、新擬盤多毛孢屬及假擬盤多毛孢屬菌株由ITS、TUB2和EF-1α 基因聯合建樹分析，鏈格孢屬菌株由ITS 和Histone-3 基因聯合建樹分析，所有引物序列和PCR 擴增程序見表1。參考菌株序列在GenBank 數據庫中下載。采用CLUSTAL W 進行序列比對分析，用MEGA 7 軟件構建N-J(neighbor-joining)系統發育樹，自舉檢驗重復1 000 次。

表1 引物序列和PCR 擴增程序Tab. 1 Primer sequence and PCR cycling conditions

1.5 復合侵染試驗

將油茶炭疽病斑中分離出的主要復合致病菌作為供試菌株，用打孔器（Φ=4 mm）在生長良好的菌落邊緣切取菌餅。參考錢恒偉等（2017）和張永樂等（2018）的方法，采用有傷接種的方式，將菌餅接種在油茶嫩葉和蘋果果實上，共設3 個處理，1）先接種炭疽菌屬菌，再接同種菌株；2）先單獨接種擬盤多毛孢屬或新擬盤多毛孢屬病菌，再接種同種菌株；3）復合接種，即先接種炭疽菌屬病菌，再接種擬盤多毛孢屬或新擬盤多毛孢屬病菌。待首次接種油茶葉片和蘋果果實開始出現病斑后，去除所有接種菌塊，再接種同種或不同種真菌，置于28 ℃繼續培養2～3 天。每個處理重復6 次，無菌PDA 作為對照。觀察葉片和蘋果果實發病情況并記錄病斑大小。

1.6 殺菌劑毒力測定

采用菌絲生長速率法測定6 種殺菌劑對油茶致病菌的抑菌活性，通過預試驗得到供試藥劑對不同致病菌的有效濃度范圍。啶酰菌胺和氟吡菌酰胺為10、25、50、75、100 μg·mL-1；嘧菌酯和啶氧菌酯為0.005、0.01、0.02、0.04、0.16、5、25，50 μg·mL-1；咪鮮胺為0.025、0.05、0.1、0.2、0.4 μg·mL-1；苯醚甲環唑為0.125、0.25、0.5、1.5、3、4.5 μg·mL-1。從活化3 天的菌落邊緣切取菌餅（Φ=4 mm），分別接種到含有咪鮮胺、苯醚甲環唑、啶酰菌胺和氟吡菌酰胺的PDA 平板，含有嘧菌酯和10、25 μg·mL-1SHAM、啶氧菌酯和10、25 μg·mL-1SHAM 的AEA 平板上，28 ℃培養4 天。分別以含甲醇的PDA 培養基、含甲醇和10、25 μg·mL-1SHAM的AEA 培養基為對照，采用十字交叉法測量菌落直徑。

1.7 數據處理

Excel 軟件計算菌絲生長抑制率，DPS 軟件計算有效抑制中濃度（EC50）。

2 結果與分析

2.1 油茶炭疽病斑中絲狀真菌致病性測定及形態特征

采用組織分離法，從油茶炭疽病病葉樣本中分離獲得186 株絲狀真菌，通過回接實驗測定它們的致病性，發現這些菌均能引起油茶葉片發病。根據形態特征，可初步將這些菌分為三大類：第一類130 株，在PDA 平板上菌落圓形，邊緣整齊，菌絲生長初期為白色絨狀，后期轉變為灰色或淺褐色。分生孢子長橢圓形或圓柱形，兩端鈍圓或一端稍尖，單孢，無隔膜，無色；第二類為50 株，PDA 平板上菌落近圓形，白色，后期菌落中央呈淺褐色，由中央向外擴展，有的呈輪紋狀，培養后期在PDA 培養基上可以產生黑色油狀黏液，即為分生孢子堆。分生孢子為紡錘形或梭形，5 個細胞，有隔膜，頂端和基部細胞顏色淺，多為透明狀，中間3 個細胞顏色較深，多為褐色，頂端有2～4 根無色透明的附屬絲，基部有1 根短柄；第三類6 株，PDA平板上菌落圓形，中央墨綠色絨狀，邊緣白色，氣生菌絲濃密。分生孢子褐色或黃褐色，棍棒狀、倒梨形或卵形，有1～5 個橫隔膜，0～3 個縱斜隔膜，多數具有喙。根據菌株的形態特征，初步鑒定第一類為炭疽菌屬真菌，第二類為類擬盤多毛孢屬真菌，第三類為鏈格孢屬真菌，進一步需要采用分子生物學方法確定。

2.2 分子生物學鑒定

對186 株菌株分別進行不同基因擴增測序，將獲得的序列與GenBank 中已知種序列進行比對分析，并下載參考菌株構建N-J 系統發育樹。結果表明，130株炭疽菌屬菌株聚為6 個分支（圖略），占總分離菌株的69.9%，其中56 株以99%的支持率與果生炭疽菌參考菌株聚為1 支，在湖南、海南、廣西，廣東和江蘇采樣點均有分布；6 株以99%的支持率與C. aeschynomenes參考菌株聚為1 支，全部采自湖南；40 株以98%的支持率與暹羅炭疽菌參考菌株聚為1 支，采自湖南、海南、廣西和廣東；9 株以99%的支持率與膠胞炭疽菌參考菌株聚為1 支，采自江蘇和湖南兩地；14 株以98%的支持率與山茶炭疽菌參考菌株聚為1 支，分布在湖南和廣東兩地；5 株為未知種Colletotrichumsp.。18 株擬盤多毛孢屬菌株，占總分離菌株的9.7%，其中3 株與秤鉤風擬盤多毛孢菌（P. diploclisia）參考菌株聚為1 支，1 株與P. humus參考菌株聚為一支，1 株與P. parva參考菌株聚為一支，2 株與玫瑰紅擬盤多毛孢(P. rosea)參考菌株聚為一支，11 株為未知種Pestalotiopsissp.；4 株假擬盤多毛孢屬菌株聚為2 個分支，占總分離菌株的2.2%，其中1 株以100%的支持率與Pseudo. camelliae-sinensis參考菌株聚為1 支，3株為未知種Pseudopestalotiopsissp.；28 株新擬盤多毛孢屬菌株，占總分離菌株的15.6%，其中2 株與Neo.saprophyta參考菌株聚為1 支，3 株與Neo. cubana參考菌株聚為1 支，23 株為未知種Neopestalotiopsissp.。6 株鏈格孢屬菌株聚為3 個分支，占總分離菌株的3.2%，其中2 株以100%的支持率與鏈格孢參考菌株聚為1 支，1 株與細極鏈格孢參考菌株聚為一支，3 株未知種Alternariasp.。因此，基于形態學特征和rDNAITS、ApMat、TUB2，EF-1α 和Histone-3基因序列分析，可以確定油茶炭疽病斑中的致病菌有炭疽菌屬、擬盤多毛孢屬、新擬盤多毛孢屬、假擬盤多毛孢屬和鏈格孢屬真菌。

2.3 油茶炭疽病同一病斑分離出多種致病菌

對106 個病斑分離出的致病菌種類進行統計分析，結果發現，分離出單一炭疽病菌的病斑55 個，而能同時分離出炭疽病菌和其他致病菌的病斑有51 個，占總分離病斑的48.1%。統計分析發現，油茶炭疽病斑復合致病菌的組合方式有7 種，分為炭疽菌屬（同屬不同種）真菌；炭疽菌屬和擬盤多毛孢屬或新擬盤多毛孢屬或假擬盤多毛孢屬或鏈格孢屬真菌；炭疽菌屬，擬盤多毛孢屬和新擬盤多毛孢屬或鏈格孢屬真菌。其中炭疽菌屬和新擬盤多毛孢屬，炭疽菌屬和擬盤多毛孢屬致病菌這2 種組合方式最多，占總復合菌株病斑的41.2%和27.5%（圖1），分布在湖南、海南、廣西、廣東和江蘇樣品采集地，說明復合菌株共同侵染的現象廣泛發生在我國油茶種植區；其次是炭疽菌屬（同屬不同種），占總復合菌株病斑的15.7%，分布在湖南，廣東和海南。試驗結果表明，油茶炭疽病中存在炭疽菌屬真菌和其它致病菌復合侵染的現象。

圖1 病斑分離出的致病菌組合方式Fig. 1 Combination pattern of pathogens isolated from symptomatic diseased tissues

2.4 油茶炭疽病斑中存在復合侵染協同增效現象

根據油茶炭疽病斑中分離出的復合致病菌，將炭疽菌屬和擬盤多毛孢屬，炭疽菌屬和新擬盤多毛孢屬，炭疽菌同屬不同種這3 種分離率最多的組合方式致病菌回接到油茶上，進行復合侵染試驗。研究結果顯示，炭疽病菌和擬盤多毛孢屬真菌接種油茶葉片5 天，復合接種的葉片發病程度較只接同種炭疽菌的更嚴重，統計分析表明病斑直徑對比組間存在顯著差異（圖2A，2B，2C）；炭疽病菌和新擬盤多毛孢屬真菌復合接種的病斑顯著大于只接同種炭疽菌（圖2D，2E，2F）；不同種炭疽菌復合接種的病斑大小與只接同種炭疽病菌差異不顯著。試驗結果表明，油茶炭疽病斑中存在炭疽病菌和其他致病菌復合侵染協同增效現象。為探究在其他寄主植物上是否也存在類似的現象，筆者在蘋果果實上進行了復合侵染試驗。試驗結果顯示，炭疽病菌和新擬盤多毛孢屬真菌先后復合接種的病斑大于只接同種炭疽菌的病斑，統計分析差異顯著（圖2G，2H），說明在其他寄主植物中也存在炭疽屬真菌和其它致病菌復合侵染現象。研究結果表明，油茶炭疽病斑中的炭疽菌屬、擬盤多毛孢屬和新擬盤多毛孢屬真菌之間存在復合侵染協同增效現象。

圖2 油茶葉片和蘋果復合接種致病力測定Fig. 2 Symptoms of oil-tea leaves and apples after compound inoculation of pathogens

2.5 不同殺菌劑對油茶炭疽病復合病菌的抑制作用存在差異

6 種殺菌劑對油茶炭疽病致病菌的室內毒力測定結果顯示，啶酰菌胺和氟吡菌酰胺對炭疽菌屬和新擬盤多毛孢屬致病菌幾乎沒有抑制作用，在50 μg·mL-1供試濃度下，菌絲生長抑制率在12.7%～43.3%之間（表2）。咪鮮胺和苯醚甲環唑對炭疽菌屬、擬盤多毛孢和新擬盤多毛孢屬致病菌均具有很強的抑制作用，EC50在0.011～0.555 μg·mL-1之間（表3）。嘧菌酯和啶氧菌酯對擬盤多毛孢屬和新擬盤多毛孢屬真菌具有一定的抑制作用，EC50在0.007～0.020 μg·mL-1之間，但這2 種殺菌劑在50 μg·mL-1供試濃度下對炭疽菌的抑制作用較差。且同一殺菌劑對不同炭疽菌的抑制作用存在差異，嘧菌酯和啶氧菌酯對山茶炭疽菌C.camelliae的抑制作用強于果生炭疽菌C. fructicola、暹羅炭疽菌C. siamense 和膠胞炭疽菌C. gloeosporioides，這表明山茶炭疽菌對這兩種殺菌劑更為敏感。試驗結果表明，在供試的6 種殺菌劑中，咪鮮胺和苯醚甲環唑對油茶炭疽病復合病菌的毒力較強，其次是嘧菌酯和啶氧菌酯，而啶酰菌胺和氟吡菌酰胺對復合病菌幾乎沒有抑制作用。

表3 4 種殺菌劑對油茶炭疽病菌的室內毒力測定①Tab. 3 Toxicity test of four fungicides against pathogens of Camellia oleifera

3 討論

3.1 油茶炭疽病菌的種類與分布

本研究分離獲得186 株致病菌，其中130 株為炭疽菌，56 株為果生炭疽菌，分離率最高，其次是暹羅炭疽菌、山茶炭疽菌和膠胞炭疽菌，這與李河等報道的果生炭疽菌是油茶炭疽病的優勢致病菌的結果一致（李河等，2014；2017；Li, 2019）。在樣本采集地湖南、海南、廣西，廣東和江蘇等地均發現存在果生炭疽菌，說明這類病原菌分布范圍廣，環境適應能力強，這與李河等（2014）報道的結果一致。除果生炭疽菌以外，江蘇省只分離出膠胞炭疽菌，廣西省和海南省只分離出暹羅炭疽菌，14 株山茶炭疽菌中13 株來自于廣東省，這是否與病原菌種類的分布存在地理區域差異有關，有待進一步研究。

3.2 植物病害中存在病原菌復合侵染現象

目前關于由多種病毒復合侵染引起植物病害的報道較多，如番茄褪綠病毒ToCV 和番茄黃化曲葉病毒TYLCV 復合侵染番茄植株，且影響與寄主和昆蟲媒介的互作（Ontiveroset al., 2021）。趙麗玲等（2020）報道了中國南瓜曲葉病毒SLCCNV 和野茼蒿黃脈病毒CraYVV 復合侵染引起水茄發病，并發現在CraYVV 發生區域，病毒SLCCNV 與CraYVV 存在協同作用。在真菌引起的植物病害中也存在復合侵染現象。張永樂等（2018）對山東省茶褐枯病病原菌進行了研究，結果發現該病害是由圍小叢殼菌山茶專化型（Glomerella cingulatef. sp.camelliae）和葡萄座腔菌（Botryosphaeria dothidea）復合侵染引起的。錢恒偉等（2017）對青島市甘薯莖枯病的病原菌尖孢鐮刀菌和細極鏈格孢進行了致病力研究，結果表明，這2 種病原菌均可引起甘薯莖枯病，且病原菌混合接種較單獨接種的發病率高，致病力強。李培琴等（2021）研究表明互隔交鏈孢（Alternaria alternata）和芍藥生擬盤多毛孢（Pestalotiopsis paeoniicola）既可單獨侵染也可復合侵染引起皇帝陵側柏葉枯病，且二者病原菌復合侵染比單獨接種時的發病率高，發病程度也更為嚴重。本研究對油茶炭疽菌屬、擬盤多毛孢屬和新擬盤多毛孢屬致病菌進行復合侵染試驗，結果發現，存在炭疽病菌和其他致病菌復合接種較先后均接種炭疽病菌的致病力強，發病程度更嚴重，這與李培琴等報道的Alternaria alternata和Pestalotiopsis paeoniicola復合侵染引起黃帝陵側柏葉枯病更嚴重的結果一致，表明油茶炭疽病斑中存在炭疽病菌和其他致病菌復合侵染協同增效現象，這些病原在復合侵染過程中可能存在一定的互作，但具體的作用機制仍需進一步研究。蘋果復合侵染試驗結果進一步驗證，炭疽病菌、擬盤多毛孢屬和新擬盤多毛孢屬致病菌之間極可能存在協同作用，在其它寄主植物內可能也存在炭疽病菌和其他致病菌復合侵染現象。

3.3 殺菌劑種類與病原菌抑菌效果的關系

甲氧基丙烯酸酯（QoI）類、琥珀酸脫氫酶抑制劑（SDHI）類及甾醇脫甲基抑制劑(DMI)類殺菌劑是目前使用最多的三類殺菌劑，具有抗菌譜廣，活性高等特點（嚴明，2016）。DMI 類殺菌劑被廣泛應用于炭疽病的防治。徐從英等（2021）報道了咪鮮胺對橡膠樹炭疽病菌C. siamense的抑制活性最好。劉霞等（2013）研究發現咪鮮胺、戊唑醇和三唑酮對核桃炭疽病菌C.gloeosporioides的防治效果較好。本研究結果表明，咪鮮胺和苯醚甲環唑對油茶炭疽病菌（C. fructicola、C. siamense、C. camelliae，C. gloeosporioides）均具有較強的抑制作用，同時這兩種殺菌劑對油茶擬盤多毛孢和新擬盤多毛孢致病菌也具有較強的室內毒力。由于DMI 類殺菌劑作用位點單一，容易產生抗性，后續可考慮與甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑復配使用。QoI 類和SDHI 類殺菌劑均為線粒體呼吸抑制劑，通過阻礙電子傳遞，影響細胞能量的合成和供給，從而抑制菌絲生長。徐娜娜等（2021）研究表明氟吡菌酰胺和啶氧菌酯對牡丹炭疽病菌C. gloeosporioides的抑制活性較強，EC50值分別為0.013 8 μg·mL-1和0.032 4 μg·mL-1。這與高楊楊（2021）報道的辣椒炭疽菌（C. gloeosporioides、C. fructicola等）對氟吡菌酰胺和啶酰菌胺表現天然不敏感的結果不一致。本試驗結果發現氟吡菌酰胺和啶氧菌酯對油茶炭疽病菌（C. fructicola、C. siamense、C. camelliae，C. gloeosporioides）的抑制活性較弱，表明不同寄主植物的同種病原菌對殺菌劑的敏感性具有差異性。

本試驗測定了6 種殺菌劑對油茶炭疽菌屬、擬盤多毛孢屬和新擬盤多毛孢屬致病菌菌絲生長的抑制作用，研究結果為油茶炭疽病的防治提供參考，但本試驗工作均在實驗室內完成，環境條件較為穩定，而田間施藥會受到多種因素如溫度、降雨等因子影響，藥劑的防治效果可能會有差異，因此本試驗結果還需田間試驗驗證。

4 結論

對湖南、海南、廣西，廣東和江蘇5 地油茶成林葉部炭疽病斑的致病菌進行分離鑒定，發現油茶炭疽病同一病斑能分離出多種致病菌，并發現油茶炭疽病斑中存在炭疽病菌和其他致病菌復合侵染協同增效現象；進一步對油茶炭疽病斑中多種致病菌進行防治藥劑篩選，結果表明咪鮮胺和苯醚甲環唑的抑菌效果最好，可作為防治油茶炭疽病的首選殺菌劑。