大西洋鱈魚肌紅蛋白血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制肽的計算機模擬評估

◎ 武 琦，徐春明，田 源，韓愛萍，劉孝飛，李振華

（1.北京工商大學(xué) 輕工科學(xué)技術(shù)學(xué)院，北京 100048；2.北京玫瑰日記生物科技有限公司，北京 100024；3.北京有肌時代科技有限公司，北京 100024）

高血壓是常見的心血管疾病。在人體的血壓調(diào)節(jié)中，腎素-血管緊張素系統(tǒng)（Renin-Angiotensin System，RAS）和激肽釋放酶-激肽系統(tǒng)（Kallikrein-Kinin System，KKS）起重要作用[1]，在RAS系統(tǒng)中，血管緊張素原水解產(chǎn)生血管緊張素Ⅰ（AngⅠ）在血管緊張素轉(zhuǎn)化酶（Angiotensin Converting Enzyme，ACE）的作用下水解生成血管緊張素Ⅱ，在血管中促進平滑肌收縮，增大血管壓力，引起升壓反應(yīng)[2]。而ACE抑制肽可阻礙ACE參與以上的生化反應(yīng)，從而降低血壓。目前市面上銷售及臨床應(yīng)用的主要合成降壓藥物為血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑（Angiotensin Converting Enzyme Inhibitors，ACEI）、血管緊張素受體阻滯劑（Angiotensin Receptor Blockers，ARB）以及鈣拮抗劑（Calcium Channel Blockers，CCB）[3]，但長期服用藥物會有一定的副作用，因此目前越來越關(guān)注從食物中尋找能降低血壓的營養(yǎng)成分。

生物活性肽具有降血壓、激素調(diào)節(jié)、免疫調(diào)節(jié)和抗血栓等生物學(xué)功能[4]，但這些肽在經(jīng)過胃腸時會被酶水解改變結(jié)構(gòu)，從而影響ACE抑制肽的活性，因此利用計算機模擬評估肽的活性是必不可少的。計算機模擬評估的方法具有快速、高效以及高通量的優(yōu)點，傳統(tǒng)的體外模擬實驗費時費力，實驗結(jié)果受外界影響大，而計算機模擬研究能在更短的時間內(nèi)對肽進行低成本的初級篩選[5]。因此，本研究將利用計算機模擬評估的方法從食物中提取生物活性肽，并進行分子對接，分析其ACE抑制肽的活性。

大西洋鱈魚（Gadus morhua）因高經(jīng)濟價值被人類廣泛食用。魚蛋白的水解物具有多種生物活性[6]，被人體消化后具有一定的降壓效果。研究表明存在于骨骼、肌肉中的內(nèi)源性生物活性肽[7]對降低高血壓具有重要作用[8]。因此，本研究針對大西洋鱈魚肌紅蛋白的生物學(xué)活性，通過計算機模擬來分析該肌紅蛋白產(chǎn)生ACE抑制肽的潛力，提出了一種可替代ACE抑制肽藥物的方法，為從食品中尋找ACE抑制肽提供參考。

1 材料與方法

1.1 蛋白質(zhì)氨基酸序列查找

在NCBI數(shù)據(jù)庫（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）中輸入大西洋鱈魚的拉丁名Gadus morhua選擇protein檢索出該鱈魚的所有蛋白質(zhì)序列，找到并下載由145個氨基酸組成的肌紅蛋白序列。

1.2 計算機模擬胃腸道消化

將從NCBI數(shù)據(jù)庫中得到的肌紅蛋白氨基酸序列在Peptide Cutter（https://web.expasy.org/peptide_cutter/）模擬酶解。

選用胃蛋白酶（EC 3.4.23.1）來模擬胃消化，胰蛋白酶（EC 3.4.21.4）和胰凝乳蛋白酶（EC 3.4.21.1）模擬胃腸消化，將肌紅蛋白序列切割為2～13個肽的短肽鏈，將短肽在Peptide Rank中根據(jù)具有生物活性的預(yù)測概率對肽進行排序。

1.3 BIOPEP分析

利用BIOPEP數(shù)據(jù)庫（https://biochemia.uwm.edu.pl/biopep-uwm/）預(yù)測大西洋鱈魚肌紅蛋白中潛在的ACE抑制肽，并與該數(shù)據(jù)庫內(nèi)已知的具有ACE抑制活性的肽相匹配，找到活性最高的短肽并對其進行后續(xù)分析。將已切成短肽的血紅蛋白依次導(dǎo)入BIOPEPUWM的“酶促工具”分析中，在結(jié)果界面將會顯示其是否具有潛在的生物活性，可根據(jù)A、B值的大小從中選擇具有潛在ACE抑制活性的肽并做進一步分析。

1.4 計算機模擬水解后釋放短肽的理化特性

利用Expasy（https://web.expasy.org/）和Toxin Pred（https://webs.iiitd.edu.in/raghava/toxinpred/design.php）分析肌紅蛋白經(jīng)模擬胃腸消化得到短肽的分子量大小（Molecular Weight，MW）、等電點（Isoelectric Point，PI）、理化性質(zhì)、Peptide Ranker值、凈電荷和毒性特征，為后續(xù)的分析做準備。

1.5 分子對接

從PDB數(shù)據(jù)庫（https://www.rcsb.org/）中下載ACE（PDB ID：1O86）的晶體結(jié)構(gòu)式并在Pymol中對受體結(jié)構(gòu)進行預(yù)處理，使用原結(jié)晶的坐標為ACE對接的盒子中心。使用ChemDraw 19.0繪制肌紅蛋白的三維結(jié)構(gòu)式，將兩者在AutoDock Tools 1.5.7進行分子對接，根據(jù)能量篩選最佳對接點位，對接完成后在Discovery Studio 2017中進行可視化處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 肌紅蛋白理化性質(zhì)分析

大西洋鱈魚肌紅蛋白經(jīng)過模擬胃腸消化后產(chǎn)生ACE抑制肽，利用軟件對ACE抑制肽進行分析，結(jié)果如表1所示。

表1 大西洋鱈魚肌紅蛋白中鑒定出的ACE抑制肽的肽序列、理化性質(zhì)和毒性預(yù)測表

由表1可知，大西洋鱈魚肌紅蛋白獲得的20種肽中既有二肽、三肽，也有少數(shù)多肽，所有肽都只出現(xiàn)1～2次，且分子量在188.25～1 414.83 Da，CW、LG、AGL、IPINN和ITEVIAK這5種肽的PI值為5.85～6.35，凈電荷值均為0；HMAEK、NTHGGL和AASVAVASHGATV這3種肽的PI值均為7.10，凈電荷值為0.5；TR、LKP和LFPK這3種肽的PI值＞9.0，凈電荷數(shù)為1；LGE、MADY和AGVGE這3種肽的PI值≤4，凈電荷數(shù)為-1。由表1分析可知，該大西洋鱈魚肌紅蛋白的短肽部分帶負電荷偏弱酸性，少部分帶正電荷偏弱堿性。

利用Toxin Pred軟件進行毒性預(yù)測，結(jié)果顯示從大西洋鱈魚肌紅蛋白模擬水解得到的短肽均沒有潛在的毒性，可以進一步研究開發(fā)為食品或藥品。

利用Peptide Ranker對20種肽具有生物活性的概率進行排序，從0到1分，Peptide Ranker評分的閾值設(shè)置為0.5，分值越高說明肽具有生物活性的可能性越大[9]。由表1可知，大西洋鱈魚肌紅蛋白計算機模擬水解肽中有4個肽的分值大于0.5，CW肽的分值最高為0.995 81、LFPK的分值為0.823 71，由此可知對大西洋鱈魚肌紅蛋白的分析是有研究意義的。

2.2 分子對接結(jié)果可視化

大西洋鱈魚肌紅蛋白經(jīng)計算機模擬水解后，選取其中活性概率最高的二肽CW和四肽LFPK進行下一步的分子模擬和分子對接，結(jié)果見圖1、圖2。

圖1 ACE-CW分子對接相互作用圖

圖2 ACE-LFPK分子對接相互作用圖

分子對接是基于配體和受體的“鎖-鑰原理”，該過程實際上是將小分子配體逐一放在受體蛋白具有活性的位點，通過不斷調(diào)整位置，尋找兩者結(jié)合的最佳構(gòu)象[10]，從分子角度闡述CW、LFPK和ACE的作用機制。ACE的活性中心共有S1、S2、S3 3個必須結(jié)合位點。本文研究了小分子配體與ACE活性位點之間的相互作用，選擇二肽CW的作用位點是S1和S2，LFPK的作用位點是S1、S2和S3，將CW和LFPK分別進行分子對接。

由圖1（a）和1（c）可知，在ACE-CW復(fù)合物中，兩者主要通過氫鍵作用、疏水作用、pipi-共軛作用發(fā)生結(jié)合。例如，CW與ACE的氨基酸殘基Gln281（2.3 ?）、Lys511（1.9 ?）、His353（2.4 ?）、Ala354（2.2 ?）、Glu384（2.10 ?/1.97 ?）以及His387（2.74 ?）之間形成7個距離不同的氫鍵，其中與Lys511殘基之間形成的氫鍵距離最短，結(jié)合最緊密；與His513（2.91 ?）形成碳氫鍵。CW與氨基酸殘基Val380（4.75?）形成pi-烷基鍵，與Phe457（4.75 ?）形成pi-pi共軛鍵，CW與氨基酸殘基His383（4.44 ?）和Tyr523（5.98 ?）形成pi-硫相互作用。其中，CW與ACE活性位點S1的Tyr523形成pi-硫相互作用，Ala354、Glu384形成3個氫鍵；與活性位點S2的His353、Gln281、Lys511殘基結(jié)合形成氫鍵，與His513結(jié)合形成碳氫鍵。CW與ACE活性中心的氨基酸殘基相結(jié)合，占據(jù)ACE的活性中心，抑制ACE的活性。

由圖2（a）和2（c）可知，在ACE-LFPK復(fù)合物中，兩者主要通過氫鍵作用和pi-烷基鍵發(fā)生結(jié)合。LFPK與ACE的氨基酸殘基Glu16（21.76 ?/2.03 ?）、Gln281（2.16 ?）、Thr282（3.00 ?）、Glu384（2.04 ?/2.14 ?）以及Ala354（2.53 ?）之間形成7個距離不同的氫鍵，其中與Glu162形成的氫鍵距離最短，結(jié)合最緊密；LFPK與ACE氨基酸殘基Val380形成距離為2.16 ?的碳氫鍵，與Tyr523形成距離為3.81 ?的CH-π相互作用；LFPK與Tyr523（4.63 ?）、His353（4.51 ?）和His513（4.24 ?/4.71 ?）形成pi-烷基鍵。其中LFPK與ACE活性部位S1中的Ala354和Glu384形成氫鍵；與活性部位S2中的His353和His513形成pi-烷基鍵，Gln281形成氫鍵；與活性部位S3中的Glu162形成2個距離不同的氫鍵。LFPK與ACE活性中心中的氨基酸殘基相結(jié)合，占據(jù)ACE的活性中心，抑制ACE的活性。

3 結(jié)論

本研究利用計算機初步篩選出大西洋鱈魚肌紅蛋白中的生物活性肽，它們均無毒，選取具有ACE抑制活性概率最大的CW和LFPK，利用分子對接技術(shù)分析了這2種肽的ACE抑制機制。結(jié)果顯示，CW在ACE活性中心的結(jié)合位點是S1和S2，LFPK的結(jié)合位點是S1、S2和S3，此研究結(jié)果為在食品工業(yè)中開發(fā)大西洋鱈魚肌紅蛋白作為ACE抑制肽的前體提供了理論基礎(chǔ)。