藏族人群HIF-2α基因rs1867785位點多態(tài)性與高原肺動脈高壓的關(guān)系

韓永建，常榮

(1青海大學(xué)研究生院，西寧810016；2青海省人民醫(yī)院)

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藏族人群HIF-2α基因rs1867785位點多態(tài)性與高原肺動脈高壓的關(guān)系

韓永建1，常榮2

(1青海大學(xué)研究生院，西寧810016；2青海省人民醫(yī)院)

目的 探討高原地區(qū)藏族人群低氧誘導(dǎo)因子2α(HIF-2α)基因rs1867785位點突變與高原肺動脈高壓(HAPH)的關(guān)系。方法 選取世居高海拔地區(qū)藏族人71例，存在HAPH 27例(HAPH組)，不存在HAPH 44例(對照組)，收集其一般資料，行心臟彩超檢測肺動脈收縮壓，測定血氧飽和度，行全血細(xì)胞分析，運用基因測序的方法測定HIF-2α基因rs1867785位點基因型，并分析肺動脈收縮壓與血氧飽和度、紅細(xì)胞壓積、血紅蛋白相關(guān)性。結(jié)果 兩組除肺動脈收縮壓外，一般資料、血氧飽和度及全血細(xì)胞分析指標(biāo)均無統(tǒng)計學(xué)意義。HAPH組HIF-2α基因rs1867785位點GG、GA、AA基因型分布頻率分別是7.4%、55.6%、37.0%，A、G等位基因頻率分別為64.8%、35.2%。對照組rs1867785位點GG、GA、AA基因型分布頻率分別是2.3%、25.0%、72.7%，A、G等位基因頻率分別為85.2%、14.8%。rs1867785位點3種基因型分布頻率組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.01)，HAPH組G等位基因頻率顯著高于對照組(P=0.01)。肺動脈收縮壓與血氧飽和度、紅細(xì)胞壓積、血紅蛋白無明顯相關(guān)性(P均>0.05)。結(jié)論 攜帶HIF-2α基因rs1867785位點GA基因型的藏族人群患HAPH的風(fēng)險可能較攜帶AA基因型的高，G等位基因可能為HAPH易感等位基因。

高原肺動脈高壓；低氧誘導(dǎo)因子2α；基因多態(tài)性；藏族

高原肺動脈高壓(HAPH)屬于慢性高原病的一種類型，是指居住于海拔>2 500 m地區(qū)的成人或兒童,表現(xiàn)出對高原環(huán)境不適應(yīng)的臨床癥狀和體征，如平均肺動脈壓>30 mmHg或肺動脈收縮壓>50 mmHg,右心室肥大,有中度低氧血癥,無紅細(xì)胞增多癥，同時排除由于其他疾病引起的肺動脈高壓[1]。HAPH患病率約為3.23%，年齡增加、紅細(xì)胞增多與低氧血癥是其獨立誘發(fā)因素，但與居住的海拔高度無明顯的關(guān)系[2]。藏族人長期居住于高原，是對高原環(huán)境適應(yīng)最好的人群，患慢性高原病的概率也較漢族人低，然而臨床上也能發(fā)現(xiàn)藏族HAPH患者[3，4]。故本研究以青藏高原地區(qū)藏族人群為研究對象，探討高原地區(qū)藏族人群低氧誘導(dǎo)因子2α(HIF-2α)基因rs1867785位點突變與HAPH發(fā)病的關(guān)系，尋找患慢性高原病并形成肺動脈高壓的易感基因型，為HAPH的預(yù)防、早期診斷與臨床治療提供一定的理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 2014年10月～2015年10月選擇世居(3代及以上)青海海北藏族自治州剛察縣(平均海拔3 300 m)的藏族人71例，依據(jù)第六屆國際高原醫(yī)學(xué)和低氧生理學(xué)術(shù)大會頒布的“慢性高原病青海診斷標(biāo)準(zhǔn)”[1，5]分為HAPH組與對照組。HAPH組27例，其中男11例、女16例，年齡(63.93±12.63)歲，BMI(27.39±6.37)kg/m2；HR(72.03±13.94)次/min，SBP(138.11±32.55)mmHg，DBP(83.37±12.01)mmHg，肺動脈收縮壓(54.96±5.15)mmHg；血紅蛋白(Hb)為(154.70±20.74)g/L，紅細(xì)胞壓積(HCT)為45.02%±5.17%，SaO2為89.70%±3.64%。對照組44例，男25例、女19例，年齡(60.8±11.84)歲，BMI(26.1±4.43)kg/m2；HR(75.59±11.15)次/min，SBP(137.82±25.89)mmHg，DBP(83.98±15.45)mmHg，肺動脈收縮壓(22.45±3.81)mmHg；Hb(158.04±31.2)g/L，HCT為47.18%±5.49%，SaO2為90.41%±2.16%。根據(jù)病史和輔助檢查排除：①有其他原因引起的肺動脈高壓，包含新生兒持續(xù)性高原肺動脈高壓等；②慢性阻塞性肺疾病，如慢性支氣管炎、慢性阻塞性肺氣腫、慢性肺源性心臟病等；③肺間質(zhì)疾病，如矽肺等；④其他心血管疾病。本研究對象均簽署知情同意書，且通過醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)。兩組除肺動脈收縮壓具有統(tǒng)計學(xué)差異外，其余各資料均具有可比性。

1.2 HIF-2α基因多態(tài)性檢測方法 ①基因組DNA提?。貉芯繉ο缶槿】崭轨o脈血2 mL，采用乙二胺四乙酸二鉀進行抗凝，離心后分離出白細(xì)胞層，提取基因組DNA。②引物合成：引物由北京博奧晶典生物技術(shù)有限公司合成。HIF-2α基因上游引物序列為5′-ATGCCCCTTTCCTGTGTATTTA-3′，下游引物序列為5′-TCACCAGTGAAATGTGACCTTC-3′。③基因型檢測：干冰保存DNA樣本，寄送至北京博奧晶典生物技術(shù)有限公司進行基因型檢測。目的基因片段的擴增：PCR反應(yīng)總體系為25 μL，包括滅菌雙蒸水19.05 μL，10×緩沖液2.5 μL，dNTP(2.5 mmol/L)2 μL，上游引物(50 μmol/L)0.1 μL，下游引物(50 μmol/L)0.1 μL，Tap酶(5 U/μL)0.25 μL，DNA樣本1 μL。擴增程序：96 ℃預(yù)變性3 min，35個循環(huán)(96 ℃變性25 s，60 ℃退火45 s，72 ℃延伸45 s )，72 ℃延伸5 min。1.5%瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR產(chǎn)物。運用ABI 3730XL測序儀檢測目的片段的序列，并運用SMD軟件(博奧生物有限公司)識別測序結(jié)果；去除峰圖兩端的低質(zhì)量序列，將高質(zhì)量序列與目的基因的參考序列進行對比分析，判讀rs1867785位點型別。

2 結(jié)果

2.1 Hardy-Weinberg平衡檢驗 對兩組HIF-2α基因rs1867785位點進行平衡檢驗，HAPH組和對照組P分別為0.26、0.96，均大于0.05，說明選取的樣本具有代表性。

2.2 HIF-2α基因多態(tài)性檢測結(jié)果 HAPH組HIF-2α基因rs1867785位點GG、GA、AA基因型分布頻率分別是7.4%、55.6%、37.0%，A、G等位基因頻率分別為64.8%、35.2%。對照組HIF-2α基因rs1867785位點GG、GA、AA基因型分布頻率分別是2.3%、25.0%、72.7%，A、G等位基因頻率分別為85.2%、14.8%。兩組HIF-2α基因rs1867785位點3種基因型分布頻率組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=8.91，P=0.01)，HAPH組G等位基因頻率高于對照組(χ2=7.99，P=0.01)。見表1。

2.3 肺動脈收縮壓與SaO2、Hb、HCT的關(guān)系 結(jié)果顯示，肺動脈收縮壓與SaO2、HCT、Hb無關(guān)(r分別為0.03、-0.19、-0.34，P均>0.05)。

3 討論

HAPH是由于長期高原缺氧環(huán)境造成的肺血管阻力持續(xù)發(fā)展的結(jié)果，潛在的機制包括持續(xù)性的肺血管收縮與血管壁的重塑、平滑肌細(xì)胞凋亡減少與增生造成的肺動脈中膜肥厚，長期的肺動脈高壓將造成右心負(fù)荷增大，失代償時將導(dǎo)致右心衰竭[6，7]。HIF-2α基因位于人的2號染色體p16～21區(qū)，又被稱為內(nèi)皮PAS蛋白1(EPAS1)，由Tian等[8]于1997年發(fā)現(xiàn)，主要存在于內(nèi)皮細(xì)胞中。HIF-2α的靶基因涉及到血管收縮、鐵代謝、血管生長、胎肺成熟、肝臟生長等方面，此外還與一些疾病有關(guān)，如低氧性肺動脈高壓、腫瘤、慢性阻塞性肺疾病等[9]。

表1 兩組HIF-2α基因基因型及等位基因分布情況

本研究顯示，HIF-2α基因rs1867785位點有GG、GA、AA 3種基因型，兩組基因型及等位基因頻率差異有統(tǒng)計學(xué)意義。GA基因型在HAPH組明顯占優(yōu)勢，可能為HAPH易感基因型；AA基因型可能為保護性基因型；G等位基因可能為HAPH易感等位基因。提示攜帶G等位基因的藏族人群患HAPH的風(fēng)險性可能較攜帶A等位基因的高。Newman等[10]通過運用全外顯子測序的方法對患HAPH的安格斯牛進行測序，發(fā)現(xiàn)HIF-2α基因外顯子12存在兩種變異，并且兩種獨聯(lián)體變異的基因與洛基山脈安格斯牛的HAPH明顯相關(guān)。Gale等[11]的研究也證實，HIF-2α基因的變異能導(dǎo)致嚴(yán)重的肺動脈高壓。Formenti等[12]研究發(fā)現(xiàn)，HIF-2α基因獲得性功能突變與肺動脈高壓、心輸出量、HR、肺通氣等有關(guān)。本研究與Gale與Formenti的研究一致，證實了HIF-2α基因的突變與肺動脈高壓有關(guān)，然而具體的分子機制不清楚。

HAPH的患者一般伴有低氧血癥[13]，本研究顯示HAPH組與對照組SaO2沒有明顯差異。推測原因可能為藏族人與漢族人相比，一方面有較高的肺通氣，另一方面在急性與持續(xù)低氧情況下藏族人肺血管收縮反應(yīng)較遲鈍，考慮為上述兩方面原因引起代償性結(jié)果。此外，本研究發(fā)現(xiàn)肺動脈收縮壓與SaO2、HCT、Hb無明顯相關(guān)性，進一步說明作為高原環(huán)境適應(yīng)的藏族，有少部分人群因高原不適應(yīng)出現(xiàn)肺動脈高壓與其基因有關(guān)。

綜上所述，本研究表明HIF-2α基因rs1867785位點GA基因型可能為HAPH易感基因型，AA基因型可能為保護性基因型，G等位基因可能為HAPH易感等位基因。由于HAPH的發(fā)生可能是多種基因相互作用的結(jié)果[14，15]，單個基因與基因位點作用通常很有限；此外，由于基因上的單核苷酸多態(tài)性位點有多個，每個位點在HAPH形成中的作用及其作用機制還不清楚。因此，有關(guān)HIF-2α與HAPH的關(guān)系還需進一步研究。

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Relationships between polymorphism of rs1867785 locus of HIF-2α gene and high altitude pulmonary hypertension in Tibetan population

HANYongjian1,CHANGRong

(1GraduateSchoolofQinghaiUniversity,Xining810016,China)

Objective To investigate the relationships between mutation of rs1867785 locus of HIF-2α gene and high altitude pulmonary hypertension (HAPH) in Tibetan population in plateau. Methods We selected 71 cases of native Tibetan population at high altitudes, including 27 cases of people with HAPH (HAPH group) and 44 cases without HAPH (control group). We detected pulmonary artery pressure by echocardiography, collected general information, measured oxygen saturation, did whole blood cell analysis and used gene sequencing method for the determination of genotype of rs1867785 locus of HIF-2α gene and studied the correlations between pulmonary artery systolic pressure and oxygen saturation, hematocrit and hemoglobin. Results In addition to pulmonary artery pressure, the general information, oxygen saturation and blood cell analysis parameters were not statistically significant between the two groups. The frequency distribution of genotypes GG, GA and AA of rs1867785 locus of HIF-2α gene in the HAPH group were 7.4%, 55.6% and 37.0%; A, G allele frequencies were 64.8%, 35.2%, and genotype GA dominated. They were 2.3%, 25% and 72.7%; A, G allele frequencies were 85.2%, 14.8% and genotype AA was dominant in the control group. There were significant differences among the three genotype frequencies of rs1867785 locus between the two groups (P=0.01), G allele frequency in the HAPH group was significantly higher than that of the control group (P=0.01). Conclusion Polymorphism of rs1867785 locus of HIF-2α gene is associated with susceptibility to high altitude pulmonary hypertension, and the risk of HAPH in Tibetan population carrying genotype GA may be higher than that carrying genotype AA, and G allele may be a susceptibility allele of HAPH.

high altitude pulmonary hypertension; hypoxia-inducible factor 2α gene; Tibetan nationality

國家自然科學(xué)基金資助項目(81360301)；青海省應(yīng)用基礎(chǔ)研究計劃資助項目(2013-Z-743)。

韓永建(1986-)，男，在讀碩士，住院醫(yī)師，主要研究方向為心血管疾病臨床與基礎(chǔ)。E-mail: abcdef12565219@163.com

簡介：常榮(1973-)，女，博士，主任醫(yī)師，主要研究方向為高原心血管病基礎(chǔ)與臨床。E-mail： qhschangrong@126.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.38.004

R543.2

A

1002-266X(2016)38-0013-03

2016-03-22)