食品微生物快速檢測技術研究進展

◎ 李昕夢，趙相艷

（河南牧業經濟學院，河南 鄭州 450046）

隨著人民生活水平的提高，食品安全問題日益引起人們的關注。在眾多的食品安全項目中，微生物和各種毒素所引起的環境污染日益受到人們的重視。人們開始把目光投入食源性微生物的危害。據世界衛生組織估算，每年全球有數億人因食物傳播疾病而死亡，而在發達國家，食品傳播疾病的發病率也很高，每年約有1/3 的人會因食物而受到影響，其中37.1%是由食物引起[1]。從全球來看，由沙門氏菌感染的病例數量明顯上升。據有關數據，國內70%～80%的細菌食物中毒是由沙門菌引起。微生物污染對人類健康有很大的影響，所以，加強食品安全檢查是目前我國食品行業亟須認真解決的問題。

為了在基層推廣使用，必須盡快制定一套檢測和監測食源性疾病的標準。常規的檢測手段雖然同樣具有很高的精確度和靈敏度，但是實驗次數多、操作復雜、耗時長，難以快速檢測結果。快速檢測技術是一種快速、方便、準確的檢測技術，既可保證進入市場的食品安全，又可增強食品企業的安全監管，促進企業可持續發展。因此，對食品中微生物進行準確、快速檢測的技術和方法的研究與開發已引起了世界范圍內的廣泛關注，近幾年，生物技術、微電子技術的飛速發展，使得食品微生物快速檢測技術取得了長足的進步[2]。

1 快速檢測技術的概述

目前，農藥、化肥、重金屬離子、生物毒素、病原菌等是我國食品安全污染的主要來源。快速檢測技術是指通過相關的儀器對樣品中的微生物組成進行快速的檢測與分析，從定性到定量兩個方面進行，既能有效地提高檢測的質量，又能確保檢驗的科學性；可采用現場取樣和在線快速檢驗等方法，實現對食品的微生物檢驗，避免不合格食品進入市場，確保食品的安全。

目前，微生物檢測的方法多種多樣，常用的方法是培養法。先采樣，在培養基中培養、觀察、計數，以確定食品是否受到了微生物的污染。然而，這一方法耗時較長（一般要2 ～3 天，有時還要更久），這顯然不符合現代食品快速生產的要求。因而，對食品微生物快速檢測技術的需求也越來越大。

2 食品微生物快速檢測技術

2.1 免疫分析檢測技術

2.1.1 酶聯免疫吸附技術

酶聯免疫吸附技術是放射免疫與熒光2 種檢測技術的結合，該技術是將抗原或抗體吸附到同相位的載體上，然后在載體上進行免疫酶的染色。在底物顯色后，用定量的方法測定被測物質的含量。該方法將免疫熒光法與輻射免疫檢測技術的優勢相結合，具有定量、靈敏、準確、標記穩定、適用范圍廣、結果判斷客觀、簡便徹底、檢測速度快、成本低廉等優點。

2.1.2 酶聯熒光免疫吸附技術

酶聯熒光免疫吸附技術是一種將酶體系與熒光免疫分析相結合的方法，以常規酶免疫法為基礎，以理想的熒光基質取代原有的染色基質，增加檢測的靈敏度，擴大檢測范圍，降低試劑使用量。酶放大技術、固相分離和熒光檢測聯合是目前較為靈敏的一種技術。

2.1.3 免疫熒光技術

免疫熒光技術，又稱熒光抗體技術，它是利用熒光抗體示蹤檢測抗體的一種方法，稱為熒光抗體法，而熒光抗體法是一種利用已知的熒光抗原標志物進行示蹤和檢查抗體的方法。利用熒光標記技術，將抗體和其他蛋白結合，利用顯微鏡可以檢測特定的熒光，從而識別食物中的微生物，具有特異性、敏感性和快速性等優點。這種方法無需耗費太多的時間，且具有很好的適應性[3]。

2.1.4 免疫磁珠分離技術

免疫磁珠法是一種將磁性微球和免疫化學技術相結合的新技術。這種方法是將抗體包裹的磁珠與試樣進行混合，然后用磁力設備將其收集。利用免疫磁珠法，可以較快地將食物中的目標細菌進行分離，從而解決了選擇性培養基對目標菌的抑制問題。利用免疫磁力法從乳制品、肉類、蔬菜中分離沙門菌，其檢測限為每克1×102個細菌，與其他測試手段聯合使用，可以使分離效率和檢測極限成倍增加。

2.1.5 免疫層析技術

利用免疫層析技術，結合抗原抗體特異反應，建立了一種新型的免疫測定技術。將一種特定的抗體固定在硝酸纖維素薄膜的一個區帶內，干燥的硝酸纖維素的一端被浸泡在試樣中，在毛細管的作用下，沿著薄膜向前移動到被固定的抗體區域，當樣本的抗原與抗體結合時，通過免疫膠體金和免疫酶染色，就可以在相應的部位得到染色，從而得到特異的免疫反應。在應用免疫色譜的過程中，常用的是膠體金免疫層析技術，通過膠體金進行標記。在食品微生物檢測中，免疫層析技術具有高效、準確、簡單、不會產生任何污染的優點。因此，可以很好地檢測食物中的布氏菌、沙門氏菌、霍亂弧菌等。

2.2 分子生物學檢測技術

目前，常用的分子生物學技術包括PCR、基因芯片技術、分子雜交技術等。PCR 可以根據不同的溫度對食物中的DNA 進行定向復制，具有很高的敏感性，而且不會對食品本身造成任何污染，因而被廣泛用于食品的微生物檢測。基因芯片技術是對傳統PCR 技術進行優化和改造的一種技術，其采用了分子生物學技術和自動化技術，通過一套檢測系統對芯片進行掃描，對探針與被測基因進行雜交，并對其組成進行不同的反應，從而達到對食物微生物成分的檢測，其中包含潛在致病因素、遺傳性指標等，確保了檢測的準確性。

2.2.1 PCR 技術

腸毒素大腸桿菌是一種嗜熱、嗜酸、好氧的細菌，能夠在巴氏滅菌條件下生存，對濃縮果汁的質量造成很大的影響。當前，國內外對蘋果濃縮果汁中耐高溫細菌的含量要求不超過1。目前，國內蘋果濃縮果汁生產中存在的最大問題是耐熱細菌超標。耐高溫細菌的檢測仍然是傳統的培養法，檢測時間較長，通常要4 ～5 d 才能得出結果。由于檢驗的滯后，不能對生產進行及時引導，也不能將相關的信息反饋給生產線，從而無法對其進行相應的預防、控制和清洗。PCR 技術可以在幾個小時內將DNA 擴增到幾百萬倍，并通過篩選合適的引物，將DNA 片段擴增到易于檢測的程度。因此，在理論上，可以通過特異擴增抗熱細菌的基因片段，從而達到快速檢測的目的。

2.2.2 基因芯片技術

基因芯片，也叫DNA 微陣列，是一種生物芯片。由核酸分子雜交發展而來，其是通過1 個與已知的序列結合在一起的基因探針，對不確定的序列進行雜交。在此基礎上，采用共聚焦熒光技術，將其與探針進行雜交，從而達到快速檢測基因信息的目的。其工藝主要包括樣品的處理和放大，對基因芯片進行雜交、清洗、檢測、數據處理，以及集成的信息處理。基因芯片中的數據處理與信息抽取要求對混合樣本進行準確的定位，而樣本的自動識別將直接影響芯片的檢測準確率。

2.2.3 分子雜交技術

分子雜交技術通過將DNA 和RNA 與某些微生物的核酸結合，對微生物進行診斷和識別。這種方法能夠很好地解決抗體的檢測問題，為了得到較大的樣本數量，在食物的微生物研究中，主要采用了瓊脂平板上的細菌菌落進行雜交。

2.3 代謝學技術

在微生物的代謝過程中，會產生物理化學的改變，這是一種代謝學的方法，其包括ATP 生物發光法、微量生化法。代謝學技術由于具有快速、準確、無污染等優點，目前被越來越多地采用。

2.3.1 ATP 生物發光法

ATP 是生物體內的一種不穩定物質，通過測定ATP 在體內的含量，可以得到實際的活菌數。在此基礎上，此技術利用光譜儀對食品進行熒光分析，具有操作簡單、高效等優點，廣泛應用于食品檢測。

2.3.2 微量生化法

微量生化法用于食品的微生物分析，需要采用商業化的微生化鑒別試劑，其主要有放射測量法和微熱量法。輻射測定是根據微生物生長時所釋放的放射CO2來判定微生物的真實數目[4]。微熱分析技術要求對微生物在生長過程中的溫度變化規律進行研究，以實現對微生物的識別。這2 種檢測方法具有準確、高效等優點，可應用于檢測食品中的乳酸菌、大腸桿菌和酵母菌。

2.4 免疫傳感器

免疫傳感器是一種將生物檢測技術和傳感技術有機結合的一種新的生物傳感器[5]。生物敏感單元是一種分子層，其可以將抗原或抗體固定；傳感器是把生物化學過程轉化為光和電信號；信號處理器會放大、處理、顯示或記錄光信號。當被測物體與分子識別單元特異地結合時，合成的復合體會被信號變換成能夠被輸出的光、電信號，從而實現對目標的分析和探測。

2.5 近紅外光譜技術

近紅外光譜法是以光譜技術為基礎，用于食品的質量和品種的鑒定[6]，其波長在780 ～2 526 nm。近紅外光譜是一種分子振動光譜，在近紅外光中，各種含氫的化合物對近紅外光的產合頻率及倍頻進行吸收，并利用不同的基團對其吸收波長及強度的影響，獲得了含有豐富結構和物理信息的近紅外光譜，用于食品品質的探測與分析。微生物的核酸、蛋白質等能吸收近紅外光產生的各種光譜信息，從而為微生物的結構和數量提供了依據。

2.6 高光譜成像技術

高光譜成像技術（HS）結合了光譜學和圖像技術的優點，能夠對被測食物進行光譜和圖像信息的同時探測。其光譜分辨率可達10-2λ 量級，在200 ～2 560 nm，或超過2 560 nm。高光譜成像系統包括光源、分光設備、照相機、高分光光度計以及電腦等。通過分光器件將混合光分解為不同頻率的單色光，利用高成像光譜儀將所發射的光轉化為光譜圖像，并在一定的頻譜范圍內對目標對象進行幾十到幾百個頻帶的連續成像，從而獲得含有大量樣本信息的立體譜圖像[7]。高光譜圖像具有較高的解析度，能夠探測蛋白質、核酸等成分的振動信號，同時還能為微生物的探測提供大量的信息[8]。

2.7 質譜技術

質譜法是一種新型的后基因組檢測技術，其是一種新型的檢測手段，通常用于檢測海產品的腐敗菌、革蘭氏陽性菌等。經過高效的分離，可以用質譜技術進行分析，并繪出光譜，標記特異性和特異性峰的質量數，從而提高鑒定效率。此外，質譜技術中的液相色譜分離技術也被廣泛應用于動物源雙歧菌亞種的鑒定、發酵食品的微生物鑒定。如檢測蔬菜、肉類食品是否被微生物污染時，推薦采用GC-MS、HPLC 等方法，此類方法具有成本低、檢測周期短、檢測操作方便的優點。

3 結語

微生物快速檢測技術是保障食品安全的一項重要手段，涉及的技術種類很多。因此，在實際應用中，應根據微生物檢測的需要和目的，有針對性地選用免疫分析檢測技術、分子生物學檢測技術、代謝學技術、免疫傳感器、近紅外光譜技術、高光譜成像技術、質譜技術等。這些技術解決了傳統的食品微生物檢測耗時長、成本高、檢測結果準確率低等問題，同時也為食品安全生產工作提供了技術支持。