副溶血性弧菌噬菌體在食品中的生物防控研究進展

◎ 鄭小雙，貢湘磊，谷文成，孫長花，胡 艷，梅 茹

（1.揚州市職業大學，江蘇 揚州 225009；2.江蘇旅游職業學院 烹飪科技學院，江蘇 揚州 225009；3.揚州市農產品智能測控與清潔生產工程技術研究中心，江蘇 揚州 225009）

海產品食物中毒的主要原因是食源性致病菌，副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus）就是一種主要的海洋致病菌，是全世界海產品細菌性食物中毒的主要病原菌。該菌主要存在于動物的表面組織、海底沉積物及海水中，其最大的特點是需鹽才能生長，因此海產品中常能分離出此菌。海產品可以為人們提供豐富的動物蛋白質，其需求量逐年增加。人們在食用被該菌污染的水產品后，極易引起急性腸胃炎，通常表現為腹痛、腹瀉、發燒和惡心，甚至敗血癥[1]。

控制食源性致病菌的傳統方法有物理（輻射、蒸汽、干熱）和化學兩種方法[2]，但食品經過這兩種方法處理后感官品質會受到影響。熱力殺菌技術由于溫度高，會使食物的色澤和風味發生明顯的變化，食物的營養也會流失。化學消毒劑具有腐蝕性強的特點，會損害食品加工設備。

抗生素是抵御細菌侵染的第一道防線，在水產養殖和畜牧行業發揮著重要作用，但抗生素濫用會導致海產品和環境中耐藥細菌和抗性基因的傳播。食物中殘留的抗生素或被抗生素耐藥性病原體污染的食物會嚴重影響食品安全[3]。部分國家陸續發布了各種抗生素禁令。因此，需要研發替代方法控制海產品中的病原菌，新的生物抑菌劑應該具有安全性高、高效且低廉的特點。

噬菌體是細菌的一種病毒，結構簡單，主要由核酸和蛋白質組成，有較強的宿主專一性，不感染哺乳動物細胞，只能侵染特定的一類或一種宿主菌。噬菌體是專門感染和裂解細菌的病毒，其數量龐大，易于篩選，成本低。根據噬菌體增殖方式的不同，可以將噬菌體分為溫和噬菌體和烈性噬菌體兩類。溫和噬菌體的遺傳物質能整合到宿主細胞的基因中，不能殺死宿主菌[4]。裂解性噬菌體作用于細菌細胞壁的肽聚糖層導致細菌裂解。噬菌體通過控制食源性病原菌來提高食品安全水平，本文就近年來對副溶血性弧菌噬菌體在食品中的應用進行綜述。

1 副溶血性弧菌噬菌體及其應用

1.1 副溶血性弧菌噬菌體

許東勤等[5]對部分國內外報道的副溶血性弧菌噬菌體的特性進行綜述，發現這些噬菌體都是有尾的二十面體結構，但是大小不同。噬箘體基因組在2 ～77 kb；噬箘體的最適生長溫度為30 ～37 ℃；在30 ～60 ℃能保持熱穩定性，pH=4 ～10 具有較高的活性；最佳感染復數隨著噬菌體的裂解產生較大差別。副溶血性弧菌噬菌體生長條件的特殊性為噬菌體高效率的裂解宿主菌提供了良好的物理條件。

1.2 副溶血性弧菌噬菌體在減菌方面的應用

副溶血性弧菌是海產品食物中毒的主要致病菌，許多研究人員將噬菌體應用于污染了副溶血性弧菌的海產品、海產品加工設備和器具中，使該菌得到了有效控制。多數研究者報告了新發現的噬菌體，討論了噬菌體的單一療法，少數研究者討論了雞尾酒療法、與其他抗菌劑聯合使用。已經報道的噬菌體主要來源于湖泊沉積物、海產品養殖場、海水、污水和土壤等環境中。在新鮮食品中分離到的噬菌體相對有限，從食物樣本中成功分離到噬菌體的關鍵取決于宿主菌的濃度，當食物樣本中目標細菌濃度較高時有利于噬菌體的分離。

江艷華等[6]探討了噬菌體VpJYP2 在4 ℃、15 ℃、25 ℃對生三文魚片中Vp 的控制，4 ℃條件下，在檢測7 d內，實驗組在8 h未檢出菌落，之后也未檢出菌落。15 ℃條件下，在檢測4 d 內，實驗組在8 h 菌落數降至最低，之后菌落數逐漸增加。4 ℃條件下，在檢測2 d內，實驗組在4 h 菌落數未檢出，之后逐漸增加。試驗結果顯示低溫對Vp 的抑菌效果較好，可能是由于在低溫條件下Vp 生長緩慢，噬菌體裂解量相對增加。TAN 等[7]從血蛤、蝦和沖浪蛤30 份樣品中分離出6 株噬菌體。根據宿主范圍特異性組合兩種噬菌體混合物A（Vp33、Vp22、Vp21和Vp02）和B（Vp08、Vp11）。實驗結果顯示噬菌體單獨使用、兩種混合物體外裂解活性效果均顯著，37 ℃培養24 h，單個噬菌體減菌量為2.85 ～4.60 lg CFU·mL-1。噬菌體混合物A 和B 減菌量分別為3.69 和4.81 lg CFU·mL-1。LEE 等[8]從牡蠣勻漿中分離出噬菌體VPG01，作用于人工海水中污染細菌的鹵蟲50 h，鹵蟲的存活率提高了30%。25 ℃條件下，又研究了VPG01 作為廚房設備和器具生物抑菌劑的可行性，結果發現VPG01 作用在切菜砧板上3 h，細菌數量減少3 個數量級。VPG01（MOI=10）作用在比目魚肉上6 h，細菌數降至檢測線以下水平。該研究將VPG01 和前期分離到的噬菌體VPT02 等量混合來抑制宿主細胞的生長，結果顯示兩種噬菌體存在拮抗關系，VPG01 或VPT02 單獨處理優于混合處理。兩者在形態上都是相似的長尾噬菌體科，基因組平均遺傳相似度為94.88%，拮抗作用可能是噬菌體重復感染抑制宿主細胞裂解。JANG 等[9]從魚類和貝類環境的濕沙和沉積物中分離噬菌體BPVP-3325。在液體培養基中處理6 h，實驗組OD值明顯低于對照組。室溫噬菌體在牡蠣肉上應用12 h，細菌數下降約4 lg CFU·g-1。REN 等[10]給海參喂食噬菌體預防和控制副溶血性弧菌，對照組海參存活率＜30%，噬菌體的處理組（MOI=10 和MOI=100）海參存活率提高到80%，并且高于抗生素處理組。AVT 等[11]從貽貝組織中分離出噬菌體KIT04，用不同濃度的噬菌體污染細菌培養物。結果顯示，裂解活性與MOI 成正比，MOI為100 時，能抑制細菌生長8 ～9 h。XIA 等[12]評估了F23s1 抑制蝦肉中Vp 的能力。25 ℃ F23s1 在12 h內有效抑制細菌的生長，菌落數下降1.92 lg CFU·g-1。YOU 等[13]從牡蠣中分離出噬菌體VPT02，作用于污染Vp 的鹽水蝦。MOI 為10 的噬菌體使鹽水蝦存活率從16.7%提高到46.7%。VPT02應用于即食生魚肉片時，細菌數減少了3.9 lgCFU·g-1。

1.3 副溶血性弧菌噬菌體在控制生物膜方面的應用

YANG 等[14]從污水中分離出噬菌體FE11，不僅能破壞已經形成的生物膜，而且能阻止生物膜的形成，當噬菌體濃度為1010pfu·mL-1時，才能顯著破壞形成的生物膜。但是MOI 為0.1 時，能抑制生物膜的形成。YIN 等[15]分離出3 株噬菌體，實驗結果顯示單一噬菌體和雞尾酒都能顯著性抑制細菌生物膜的形成，但不能去除已經形成的生物膜。研究人員分離到噬菌體采用的原理是噬菌體-宿主相互作用的特異性，噬菌體更有可能出現在其宿主所在的生態環境中。在試驗條件下，噬菌體治療對于防治海產中的副溶血性弧菌有效，但是在侵染晚期，其控制抑菌能力有限。副溶血性弧菌噬菌體的研究方法仍需不斷探索和評估，不同地方分離出的噬菌體也存在地域差異。

2 噬菌體治療優勢及目前存在的問題

2.1 噬菌體雞尾酒的構建注意事項

噬菌體與宿主菌的高度特異性，因此必須鑒定污染的細菌菌株，以便正確應用噬菌體。噬菌體的高度特異性可通過采用較寬宿主范圍的噬菌體或噬菌體混合物來擴大宿主范圍兩種方案來解決。然而，需要確定適宜的噬菌體雞尾酒宿主范圍，因為寬的裂解譜可能會導致抗性菌株的產生或者殺死非目標細菌。混合物中噬菌體數量也應合理選擇，過多會增加成本，達不到理想的效果。要避免使用兩個基因組相近的噬菌體，當兩株基因組相近的噬菌體侵染同一宿主菌時，核酸可能會重組，產生新的噬菌體，新的噬菌體宿主范圍和其他特性難以預測。

2.2 噬菌體治療的優勢

噬菌體的宿主特異性是指只能侵染特定的宿主細胞，尤其在胃腸道靶向特定宿主細菌時，因為噬菌體狹窄的宿主范圍不會影響其他內源性細菌，對人體無害[16]。噬菌體混合使用減少了抗性菌株的出現、能夠區分活細胞與死細胞[17]。噬菌體以指數方式自我復制，能快速裂解宿主細胞。噬菌體在自然界中無處不在，相對容易分離到新的噬菌體用來抵抗新的病原體。

2.3 存在的問題

噬菌體宿主范圍較窄，大多數研究發現只能侵染少部分菌株。噬菌體與宿主菌遺傳物質相互作用，可能會導致抗性菌株或者新的致病菌株產生。噬菌體目前還未被大眾接受，許多國家還未獲批其安全性。為了提高噬菌體混合物應用的有效性，還需要優化混合物中每種噬菌體的比例和劑量。噬菌體的生物防控需要根據海產品的種類、目標細菌、噬菌體的保質期制定合理的方案。噬菌體治療受時間限制，海產品出現癥狀后，需要花幾天時間分離和檢測細菌樣品，再匹配相應的噬菌體，受污染的海產品可能被摧毀。

3 展望

噬菌體在實驗室控制條件下，在體內體外對副溶血性弧菌的控制效果明顯，其應用效果受感染復數、治療方式、環境條件、目標細菌等多種因素影響。噬菌體在食品工業可以應用在不同階段，如直接作用于動物、植物，也可用于食品工廠生產設備，防止細菌形成生物膜。但是噬菌體在各個領域應用的標準方案、雞尾酒成分、作用時間與劑量均需要進一步研究[18]。在噬菌體商業化應用之前，需要評估噬菌體處理后海產品的安全性以及大量使用噬菌體后對生態環境的影響[19]。