基于蛋白質組學的時相性偏頭痛大鼠模型不同時間點分子機制研究

姚鈺寧 韓趙成 曹光昭 樊歡歡 曹克剛,5

(1 北京中醫藥大學東直門醫院,北京,100007; 2 河南中醫藥大學,鄭州,450046; 3 中國中醫科學院中藥研究所,北京,100091; 4 北京中醫醫院順義醫院,北京,101300; 5 北京中醫藥大學中醫腦病研究院,北京,100027)

偏頭痛(Migraine)是最常見的慢性神經系統疾病之一,被世界衛生組織列為全球第二大致殘性神經系統疾病和第三大流行疾病,困擾著全世界約15%的人口[1-2]。其發病年齡主要在10～14歲和22～44歲,易導致缺勤、誤工、誤產[3-5]。偏頭痛與腦血管病等多種疾病密切相關,同時造成巨大的經濟損失,其發病與治療機制研究是目前醫學界的重點任務之一[6-9]。

一次典型的偏頭痛發作,包括前驅期(Premonitory)、先兆期(Aura)、頭痛期(Headache)和頭痛后期(Postdrome)4個時期,臨床上在不同時期進行干預能獲得不同的療效[10]。這一特點也得到血管源性學說中血管先收縮(收縮相)后舒張(舒張相)導致頭痛發生的理論支持。為進行偏頭痛的相關研究,目前主要根據不同的發病機制學說建立動物模型,主要包括基于皮層擴散性抑制(Cortical Spreading Depression,CSD)學說的CSD模型、基于三叉神經血管學說的硬腦膜神經炎癥模型以及基于血管源性學說的硝酸甘油模型[11-21]。

基于對偏頭痛最佳干預時間點的研究需求,為解決目前動物模型對偏頭痛完整病程模擬不足的問題,團隊基于經典的硝酸甘油大鼠模型,篩選各類具有血管收縮作用的藥物,并構建具有血管收縮-舒張時相性特點的偏頭痛大鼠模型[22-23],即首先通過皮下注射多巴胺(Dopamine,DA)(20 mg/kg),45 min后皮下注射硝酸甘油(Glyceryl Trinitrate,GTN)(10 mg/kg),該模型經過了穩定性評價和藥物反證驗證。因此,本研究基于該動物模型,采用蛋白質組學技術,對不同時間點時相性偏頭痛模型大鼠的生物學過程進行探究,以期為后續偏頭痛的發病機制與治療研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 無特定病原體(Specific Pathogen Free,SPF)級雄性斯潑累格·多雷(Sprague Dawley,SD)大鼠36只,體質量190～210 g,由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供,實驗動物使用許可證號：SYXK(京)2017-0033。動物飼養條件如下：室溫為(24±2)℃,濕度為55%±5%,每日光暗環境各12 h,普通飼料喂養,可自由飲水進食。本研究通過倫理委員會審批(倫理審批號：21-07)。

1.1.2 試劑與儀器 鹽酸多巴胺注射液(上海禾豐制藥有限公司,貨號：33200314),硝酸甘油注射液(北京益民藥業有限公司,貨號：20200823),TMTpro16標記試劑盒(ThermoScientific公司,美國,貨號：A44520),SDS裂解液(碧云天,貨號：P0013G),二喹啉甲酸(Bicinchoninic Acid,BCA)試劑盒、質譜水、質譜級乙腈、甲酸(ThermoScientific公司,美國,貨號：23225、W6-4、A955-4、FCMA117-50),未染色蛋白分子量marker(ThermoScientific,美國,貨號：26610),預制膠(GenScript,貨號：M00669),苯甲基磺酰氟(Phenylmethylsulfonyl Fluoride,PMSF)、三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽[Tris(hydroxymethyl)aminomethane Hydrochloride,Tris-HCl](pH=6.8;pH=8.8)、三乙醇胺硼酸酯(Triethanolamine Borate,TEAB)(生工,貨號：A510932-0500),Tris飽和酚(Solarbio life sciences,貨號：T0250),二硫蘇糖醇(Dithiothreitol,DTT)(上海泰坦科技股份有限公司,貨號：01064272),吲哚-3-乙酸(Indole-3-acetic Acid,IAA)(生工,貨號：A600539-0005),胰酶(華利世,貨號：HLS TRY001C),無水乙醇、異丙醇(GENERAL-REAGENT,貨號：G73537B,G75885B),色譜級丙酮(沃凱,貨號：40064485);質譜儀(ThermoFisher,美國,型號：Q Exactive HF),液相系統(ThermoFisher,美國,型號：Easy-nLC 1200),臺式冷凍離心機(上海盧湘儀,型號：TGL-16A),超聲波細胞粉碎機(寧波新芝,型號：SCIENTZ-II D),SDS-PAGE凝膠電泳儀(北京市六一儀器廠,型號：DYY-6C),酶標儀(上海科華實驗系統有限公司,型號：ST-360),恒溫混勻儀(上海凈信實業發展有限公司,型號：JXH-100),全自動數碼凝膠圖像分析系統(上海天能科技有限公司,型號：Tanon-1600),eStain LG蛋白染色儀(南京金斯瑞生物科技有限公司,型號：L00760C),電子天平(上海越平科學儀器有限公司,型號：FA2004B),凍干機(寧波新芝,型號：SCIENTZ-10N),高pH分離液相色譜儀(Agilent,美國,型號：Agilent 1100 series)。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備 時相性偏頭痛大鼠模型制備：稱重后于大鼠頸部皮下注射DA,20 mg/kg,45 min后頸部皮下注射GTN,10 mg/kg,大鼠出現痛苦面容即為造模成功。大鼠痛苦面容包括：眼眶緊縮、耳朵豎起、臉頰凸起、鼻子凸起和胡須改變。

36只雄性SD大鼠隨機分為6組：空白對照組、DA注射后11 min取材DA-11組、DA注射后22 min取材DA-22組、DA注射后33 min取材DA-33組、GTN注射后1 h取材GTN-1組、GTN注射后2 h GTN-2組,每組6只。除空白對照組外,對剩余30只大鼠進行模型制備,于不同時間點取三叉神經節,并用止血鉗和眼科鑷將其從周圍組織中輕柔分開,剔除表面血液與筋膜,存入凍存管后放入液氮中保存,用于后續實驗。此外,空白對照組與GTN-2組同時間點取材。本研究中僅GTN-1組和GTN-2組大鼠完整造模,DA-11組、DA-22組、DA-33組均在造模過程中處死取材。

1.2.2 檢測指標與方法 1)蛋白質組學測序：a.蛋白提取,取出適量冷凍樣品,轉移至1.5 mL離心管中,加入SDS裂解液,并加入蛋白酶抑制劑PMSF使其終濃度為1 mmol/L。置于冰上超聲破碎,12 000×g,離心10 min,取上清,所得上清即為樣品的總蛋白溶液,采用BCA蛋白濃度法進行蛋白濃度測定并分裝后儲存于-80 ℃備用[24]。b.SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳,取10 μg蛋白,采用12% SDS聚丙烯酰胺凝膠進行分離,分離后的凝膠使用eStain ?LG蛋白染色儀進行考馬斯亮藍染色,染色后的凝膠應用全自動數碼凝膠圖像分析系統成像。c.胰蛋白酶酶解,根據測定的蛋白濃度,每個樣品取50 μg,并用裂解液將不同組的樣品稀釋調整到相同的濃度和體積。將DTT加入蛋白溶液中,使得DTT的終濃度為5 mmol/L,混勻后于55 ℃孵育30 min。在冰上冷卻至室溫,加入相應體積的碘乙酰胺,使得終濃度為10 mmol/L,充分混勻,室溫避光放置15 min。在上述溶液中加入6倍體積的丙酮沉淀蛋白,-20 ℃放置4 h以上或者過夜。4 ℃,8 000×g,離心10 min并收集沉淀,揮發丙酮2～3 min。加入100 μL TEAB(200 mmol/L)復溶沉淀,加入1/50樣品質量的胰酶Trypsin-TPCK(1 mg/mL),并于37 ℃消化過夜,酶解后的樣品凍干后于-80 ℃保存。d.肽段標記,將50 μL 100 mmol/L TEAB緩沖液加入到凍干樣品中,混勻后于1.5 mL離心管中進行標記反應。從冰箱中取出TMTpro試劑,平衡至室溫,加入20 μL無水乙腈,渦流5 min,8 000×g離心。取10 μL TMTpro試劑加入樣品中,渦流混勻,室溫放置1 h。加入5 μL 5%羥胺終止反應15 min,凍干后于-80 ℃保存。2)反相色譜分離：本研究使用Agilent 1100 HPLC高pH分離液相色譜儀,通過Agilent Zorbax Extend-C18窄徑柱(2.1 mm×150 mm,5 μm)對目標化合物進行梯度分離,流速為300 μL/min,收集8～60 min的樣品,收樣凍干。肽段分離后應用液相色譜-串聯質譜技術(Liquid Chromatography Tandem Mass Spectrometry,LC-MS/MS)系統,收集數據并保存為原始格式,進行質譜分析。數據采用Proteome Discover 2.4(Thermofisher公司)分析。質譜檢索參數見表1。

1.2.3 蛋白質組學數據分析 1)差異蛋白篩選：根據DA-11組、DA-22組、DA-33組、GTN-1組、GTN-2組和空白對照組蛋白表達水平,篩選出差異蛋白。篩選條件為：logfold change≥1 andP<0.05,其中logfold change用來評估某一蛋白在樣品間的表達水平變化倍數。2)富集分析：基因本體(Gene Ontology,GO)是對基因和蛋白功能進行限定和描述的數據庫,富集分析可以得到差異表達蛋白在GO節點中的富集顯著性。本研究通過DAVID數據庫與空白對照組比較,對DA-11組、DA-22組、DA-33組、GTN-1組、GTN-2組的差異蛋白進行GO富集分析,選取與偏頭痛相關且P<0.05的生物學過程繪制氣泡圖。3)關鍵蛋白網絡構建：首先以兩倍度中心性(Degree)中位數對靶點進行篩選,接下來以度中心性,接近中心性(Closeness),中介中心性(Betweenness)中位數對靶點進行篩選,所獲得的靶點即為關鍵靶點,并將獲得的核心靶點采用Cytoscape 3.7.1進行蛋白網絡構建,將網絡圖像可視化。

2 結果

2.1 大鼠一般情況 大鼠在造模前探索行為和運動如常;在造模后,大鼠出現明顯嗜臥,探索行為減少,運動減少,并出現痛苦面容,提示時相性偏頭痛大鼠模型造模成功。

2.2 蛋白質組分析 差異蛋白分析結果表明,與空白對照組比較,DA-11組有1 323個差異蛋白;DA-22組有1 392個差異蛋白;DA-33組有961個差異蛋白;GTN-1組有1 051個差異蛋白;GTN-2組有1 102個差異蛋白。見圖1。

2.3 差異蛋白功能富集分析及關鍵蛋白網絡構建

富集分析結果表明,DA注射后11 min取材、DA注射后22 min取材差異蛋白富集在氧化應激反應(Response to Oxidative Stress)、代謝過程(Metabolic Process)等生物學過程,DA注射后33 min取材仍以氧化應激反應為關鍵生物學過程;GTN注射后1 h取材以炎癥反應(Inflammatory Response)、凋亡(Apoptotic Process)為關鍵生物學過程;GTN注射后2 h取材中代謝過程再次發生。

2.3.1 DA注射后11 min取材差異蛋白分析結果 DA注射后11 min取材差異蛋白富集分析結果表明,氧化應激反應、代謝過程等生物學過程為注射DA 11 min后關鍵的生物學過程,另有微管(Microtubule)、細胞代謝過程(Cellular Metabolic Process)、對外部刺激的反應(Response to External Stimulus)、對細胞外刺激的反應(Response to Extracellular Stimulus)、氧化還原過程(Oxidation-reduction Process)、應激反應(Response to Stress)等多個生物學過程發生。此外,熱休克蛋白90α家族A類成員1(Heat Shock Protein HSP 90-alpha,HSP90aa1)、熱休克70 kDa蛋白4(Heat Shock 70 kDa Protein 4,Hspa4)、熱休克70 kDa蛋白5(Heat Shock 70 kDa Protein 5,Hspa5)、鳥嘌呤核苷酸結合蛋白[Guanine Nucleotide Binding Protein(G Protein) beta Polypeptide 2-like 1,Gnb2l1]、趨化因子(C-X-C基元)配體2(Recombinant Human C-X-C Motif Chemokine 2,Cxcl2)被鑒定為核心蛋白。見圖2～3。

圖3 DA注射后11 min取材核心蛋白網絡

2.3.2 DA注射后22 min取材差異蛋白分析結果 DA注射后22 min取材差異蛋白富集分析結果表明,代謝過程、氧化應激反應等生物學過程依舊為注射DA 22 min后關鍵的生物學過程,另有蛋白結合(Protein Binding)、細胞黏附分子結合(Cell Adhesion Molecule Binding)、氧化還原過程、線粒體部分(Mitochondrial Part)、小分子代謝過程(Small Molecule Metabolic Process)、微管等多個生物學過程發生。此外,Hsp90aa1、Gnb2l1、真核翻譯延伸因子1γ(Eukaryotic Translation Elongation Factor 1 gamma,Eef1g)、Hspa4、ATP合成酶,H+轉運,線粒體F1復合體,α亞基1,心肌(ATP Synthase,H+Transporting,Mitochondrial F1 Complex,alpha Subunit 1,Cardiac Muscle,Atp5a1)被鑒定為核心蛋白。見圖4～5。

圖4 DA注射后22 min取材GO富集分析結果

圖5 DA注射后22 min取材核心蛋白網絡

2.3.3 DA注射后33 min取材差異蛋白分析結果 DA注射后33 min取材差異蛋白富集分析結果表明,氧化應激反應依舊為注射DA 33 min后關鍵的生物學過程,另有氧化還原過程、抗氧化活性(Antioxidant Activity)、凋亡、細胞質(Cytoplasm)、蛋白結合、分子結構活性(Structural Molecule Activity)、ATP代謝過程(ATP Metabolic Process)等多個生物學過程發生。此外,β-肌動蛋白(Beta Actin,Actb)、整聯蛋白,β3(Integrin,Beta 3,Itgb3)、白蛋白(Albumin,Alb)、黏著斑蛋白(Vinculin,Vcl)、肌動蛋白,α2,平滑肌,主動脈(Actin,Alpha 2,Smooth Muscle,Aorta,Acta2)被鑒定為核心蛋白。見圖6～7。

圖6 DA注射后33 min取材GO富集分析結果

圖7 DA注射后33 min取材核心蛋白網絡

2.3.4 GTN注射后1 h取材差異蛋白分析結果 GTN注射后1 h取材差異蛋白富集分析結果表明,炎癥反應、凋亡為注射GTN 1 h后關鍵生物學過程,另有蛋白結合、應激反應、小分子代謝過程、氧化還原酶活性(Oxidoreductase Activity)、對外部刺激的反應、血液循環(Blood Circulation)等生物學過程發生。此外,Actb、Hspa4、Gnb2l1、伴侶蛋白含TCP1,亞基5(ε)(Chaperonin Containing TCP1,Subunit 5,Cct5)、Hspa5被鑒定為核心蛋白。見圖8～9。

圖8 GTN注射后1 h取材GO富集分析結果

圖9 GTN注射后1 h取材核心蛋白網絡

2.3.5 GTN注射后2 h取材差異蛋白分析結果 GTN注射后2 h取材差異蛋白富集分析結果表明,注射GTN 2 h后,代謝過程再次發生,另有細胞黏附(Cell Adhesion)、應激反應、氧化還原過程、氧化還原酶活性、分子功能調節(Regulation of Molecular Function)、細胞發育過程(Cellular Developmental Process)、鈣離子結合(Calcium Ion Binding)等生物學過程發生。此外,Actb、Hsp90aa1、Alb、熱休克蛋白90 kDa α(胞漿),類B成員1[Heat Shock Protein 90 kDa alpha(cytosolic),Class B Member 1,Hsp90ab1]、Hspa4被鑒定為核心蛋白。見圖10～11。

圖10 GTN注射后2 h取材GO富集分析結果

圖11 GTN注射后2 h取材核心蛋白網絡

2.3.6 收縮相和舒張相的主要生物學過程 時相性偏頭痛大鼠模型模擬了偏頭痛發作時血管收縮-舒張時相性特點,注射DA后至注射GTN前為收縮相,本研究中DA注射后11 min、22 min和33 min取材均屬于收縮相;注射GTN后,大鼠血管舒張,為舒張相,本研究中GTN注射后1 h和2 h取材屬于舒張相。將收縮相、舒張相的差異蛋白進行富集分析,結果表明,收縮相以氧化應激反應、ATP代謝過程為關鍵生物學過程,另有對鈣離子的響應(Response to Calcium Ion)、對過氧化氫的反應(Response to Hydrogen Peroxide)、過氧化氫分解代謝過程(Hydrogen Peroxide Catabolic Process)、ATP酶活性正調控(Positive Regulation of ATPase Activity)、細胞對氧化應激的反應(Cellular Response to Oxidative Stress)、急性期反應(Acute-phase Response)等生物學過程發生。見圖12。舒張相以瞬時受體電位(Transient Receptor Potential,TRP)通道的炎癥介質調節(Inflammatory Mediator Regulation of TRP Channels)、細胞黏附為關鍵生物學過程，另有氧化應激反應、內質網應激反應(Response to Endoplasmic Reticulum Stress)、過氧化氫分解代謝過程、維持血腦屏障的滲透性(Maintenance of Permeability of Blood-brain Barrier)、凋亡過程的負調控(Negative Regulation of Apoptotic Process)、急性期反應等生物學過程發生。見圖13。

圖12 收縮相富集分析

圖13 舒張相富集分析

3 討論

時相性偏頭痛大鼠模型繼承了硝酸甘油模型的優點,易于制備和復制,且同樣能在清醒狀態下觀察到大鼠的自主行為與行為學改變,同時基于血管源性學說,對于偏頭痛伴隨的先兆期-收縮相和發作期-舒張相有更好的擬合效果。

本研究基于時相性偏頭痛模型大鼠血管收縮相-舒張相的變化,選擇5個時間點和空白對照組的蛋白質組學數據進行分析,結果表明在偏頭痛發作過程中,大鼠三叉神經節中顯著表達的差異蛋白主要富集在氧化應激反應、代謝、TRP通道、炎癥介質調節等相關生物學過程。在血管收縮相時,偏頭痛大鼠整體處在氧化應激的狀態中,血管持續收縮;在血管舒張相時,偏頭痛大鼠發生TRP通道的炎癥介質調節等生物學過程。提示偏頭痛大鼠在發病過程中存在炎癥反應與能量代謝變化。

代謝過程是偏頭痛發作過程中的重要環節,其中能量代謝對偏頭痛的發生和加重都具有影響,該假說于1982年被提出,研究表明腦能量代謝障礙與偏頭痛的發作關系密切,其中線粒體酶功能異常是導致腦能量代謝障礙的常見原因[25-26]。偏頭痛的發病與氧化應激反應密切相關,本研究結果提示偏頭痛可能在先兆期處于氧化應激狀態,激活的炎癥反應或能量代謝異常導致偏頭痛的發生[27]。也有研究顯示硝酸甘油注射液誘導的偏頭痛模型大鼠體內存在氧化應激反應,抗氧化通路核轉錄因子紅系2相關因子2/抗氧化響應元件(Nuclear Factor-erythroid 2-related Factor 2/Antioxidant Response Element,Nrf2/ARE)被激活,疲勞狀態可以加重偏頭痛模型大鼠體內的氧化應激反應[28]。

偏頭痛的發作與TRP通道的動態調控密切相關。TRP通道是位于細胞膜上的一類重要的陽離子通道,參與疼痛、炎癥反應、新陳代謝等各種生理和病理過程[29-30]。其中瞬時受體電位香草酸1(Transient Receptor Potential Vanilloid 1,TRPV1)和瞬時受體電位錨蛋白1(Transient Receptor Potential Ankyrin 1,TRPA1)是TRP通道大家族的成員,廣泛分布于中樞神經系統。TRPV1介導溫度覺和痛覺,TRPA1常與TRPV1共表達,感受傷害性冷刺激和疼痛感覺[31]。TRPV1和TRPA1可以被廣泛的內源性和外源性刺激激活,產生降鈣素基因相關肽(Calcitonin Generelated Peptide,CGRP)等神經肽,并通過氧化應激、炎癥反應等多個信號通路參與偏頭痛的過程[32-33]。

人體在勞累、失眠或寒冷等刺激下,激活氧化應激反應,激活三叉神經節神經元TRPA1/TRPV1通道及其調控因子磷脂酶B(Phospholipase B,PLB)、蛋白激酶A(Protein Kinase A,PKA)、PKG等,啟動一系列級聯反應,釋放CGRP、P物質(Substance P,SP)等神經遞質,并通過三級神經元將傷害性信號向上傳遞至大腦皮質,導致頭痛[34-35];同時CGRP、SP等神經遞質不斷刺激肥大細胞脫顆粒,導致炎癥介質的釋放,反饋刺激TRPA1/TRPV1不斷開放,持續生成痛覺信號,使頭痛越來越劇烈[36-37]。同時機體自我調控,通過激活內源性抗氧化系統,升高抗氧化酶的活性,并產生細胞保護性蛋白,對抗氧化應激反應,使大腦抗氧化能力恢復平衡,以緩解偏頭痛[38-39]。

偏頭痛的發病機制復雜,涉及多種生物學過程,分子-機制隨疾病進展而產生變化,可能與能量代謝、炎癥反應、氧化應激反應、血管舒張和收縮等過程密切相關,相關的TRP通道也是偏頭痛機制研究的重要方向。本研究同時體現了對發作-緩解類疾病動態認識的重要性,基于該思想的機制及干預療效研究,將推動偏頭痛精準醫療的進展。

利益沖突聲明：無利益沖突。