瞬時受體電位香草酸亞型1在缺血性中風機制及相關(guān)中藥的研究進展

張鴻瑞 高 穎,2 賴新星,2 高永紅 曹克剛,2 許穎智,2 薛冰潔,2 李丹溪,2 劉珍洪,2

(1 北京中醫(yī)藥大學東直門醫(yī)院,北京,100700; 2 北京中醫(yī)藥大學中醫(yī)腦病研究院,北京,100700)

中風是世界第二大致死疾病,亦是我國成人致死的首要原因,中風帶來的負擔日益加重[1]。其中,缺血性中風(Ischemic Stroke,IS)占70%以上。腦組織缺血后誘發(fā)能量衰竭、細胞內(nèi)鈣超載、興奮性毒性、神經(jīng)炎癥、血腦屏障損傷、氧化應(yīng)激等一系列復雜的級聯(lián)損傷,最終導致細胞程序性凋亡和腦組織永久性壞死[2]。其中Ca2+穩(wěn)態(tài)破壞(Ca2+內(nèi)流所致鈣超載)發(fā)生較早,是腦缺血后級聯(lián)損傷的上游關(guān)鍵環(huán)節(jié),與興奮性毒性和神經(jīng)炎癥等病理事件串擾互作[3-5]。既往N-甲基-D-天冬氨酸(N-methyl-D-aspartic Acid,NMDA)和α-氨基-3羧基-5-甲基-4-異口惡唑丙酸(α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazole-propionic Acid,AMPA)谷氨酸受體被認為是中風后神經(jīng)元Ca2+內(nèi)流的主要受體,大量神經(jīng)保護劑的研發(fā)以NMDA和AMPA受體為靶標。然而NMDA和AMPA拮抗劑的臨床試驗均因治療窗口窄和不良反應(yīng)而未能顯示出預期的效果[6]。近年來,誘導Ca2+內(nèi)流的非谷氨酸機制越來越受到關(guān)注。其中鈣通道瞬時受體電位香草酸亞型1(Transient Receptor Potential Vanilloid 1,TRPV1)不僅參與中風后鈣穩(wěn)態(tài),而且對興奮性毒性、神經(jīng)炎癥等病理過程發(fā)揮重要調(diào)控作用,成為神經(jīng)保護藥物研發(fā)的新興靶標[7]。TRPV1屬于瞬時受體電位通道(Transient Receptor Potential,TRP)家族,1997年由諾爾貝生理學或醫(yī)學獎獲得者David Julius教授從大鼠背根神經(jīng)節(jié)(Dorsal Root Ganglia,DRG)中發(fā)現(xiàn)并克隆。TRPV1可被外源性物質(zhì)如辣椒素、大麻素等激活,也可被熱刺激(>43 ℃)、H+(pH<6.0)等傷害性刺激和內(nèi)源性物質(zhì)激活[8]。另外,相關(guān)研究陸續(xù)發(fā)現(xiàn)調(diào)控TRPV1激活/抑制是中藥發(fā)揮抗缺血損傷的重要機制。本文將從TRPV1參與IS的病理機制及中風中藥中TRPV1激動劑/抑制劑進行梳理,挖掘臨床防治IS的新策略。

1 TRPV1的結(jié)構(gòu)及分布

1.1 結(jié)構(gòu) TRP家族是一類位于細胞膜上的非選擇性陽離子通道,首個TRP通道由COSENS和MANNING[9]在果蠅中發(fā)現(xiàn)。TRP通道在哺乳動物中共有28個成員,根據(jù)氨基酸序列的同源性分為TRPC、TRPV、TRPM、TRPA、TRPML及TRPP 6個亞群[10]。TRP通道均由4個相同或相似的亞基組成,每個亞基中跨膜結(jié)構(gòu)域S1～S4組成傳感區(qū),S5與S6之間有供離子通過的孔道環(huán),位于細胞內(nèi)的N端與C端,在不同的亞群中存在結(jié)構(gòu)差異[10]。人類TRPV1基因位于染色體17p13,編碼形成839個氨基酸95 kD大小的TRPV1蛋白[11]。N端的33個氨基酸殘基形成可與鈣調(diào)蛋白結(jié)合的3個親水性錨蛋白重復序列;C端的TRP樣結(jié)構(gòu)域中Glu684-Arg721被認為是TRPV1四聚體化的相關(guān)區(qū)域[12]。

1.2 分布 TRPV1在神經(jīng)元、小膠質(zhì)細胞等腦組織中廣泛分布[13]。腦血管內(nèi)皮細胞中也發(fā)現(xiàn)有TRPV1的表達[14]。另外,海馬CA1～CA3區(qū)、齒狀回的錐體神經(jīng)元、小腦皮質(zhì)及多數(shù)浦肯野細胞的胞體和軸突周圍,以及基底神經(jīng)節(jié)、丘腦、下丘腦、大腦腳、腦橋核、導水管周圍灰質(zhì)與小腦齒狀核均發(fā)現(xiàn)TRPV1的表達[15]。

2 TRPV1在IS病理發(fā)生中的作用

2.1 鈣超載 Ca2+在神經(jīng)元興奮性、突觸可塑性及程序性細胞死亡中發(fā)揮重要作用,Ca2+升高影響IS神經(jīng)功能預后[16]。缺血后Ca2+大量內(nèi)流引起鈣超載,激活半胱氨酸蛋白酶,降解細胞骨架蛋白、膜受體和代謝相關(guān)酶[17]。鈣超載還導致谷氨酸釋放,過度激活谷氨酸受體,產(chǎn)生興奮性毒性,最終導致神經(jīng)元死亡[16]。同時,細胞內(nèi)Ca2+通過電壓依賴性陰離子通道和Ca2+單向轉(zhuǎn)運體進入線粒體,胞質(zhì)鈣濃度升高可引發(fā)線粒體鈣超載[16,18]。線粒體鈣超載導致線粒體功能障礙,線粒體腫脹、外膜破裂,釋放促凋亡蛋白,誘導神經(jīng)元凋亡[19]。此外,細胞內(nèi)Ca2+還通過激活氧合酶,影響線粒體Ca2+穩(wěn)態(tài)和能量代謝等,促進活性氧(Reactive Oxygen Species,ROS)產(chǎn)生,誘導氧化應(yīng)激[17]。TRPV1作為非選擇性陽離子通道,主要滲透Ca2+和Na+,PCa/PNa為9.6[20]。辣椒素是TRPV1的典型激動劑,半數(shù)應(yīng)濃度(Median Effective Concentration,EC50)為39.1 nmol/L[8]。谷氨酸刺激NMDA受體過度激活,誘發(fā)Ca2+內(nèi)流。在培養(yǎng)的大鼠皮層神經(jīng)元中,3 μmol/L辣椒素預處理1 h可以明顯降低谷氨酸誘發(fā)的鈣內(nèi)流,并且下調(diào)NMDA的表達豐度,在TRPV1敲除神經(jīng)元中這種作用消失,提示辣椒素依賴TRPV1作用來降低谷氨酸誘發(fā)的鈣內(nèi)流和下調(diào)NMDA表達[20]。TRPV1過度激活是有害的,可以導致線粒體Ca2+穩(wěn)態(tài)失衡,破壞線粒體膜電位,誘導ROS產(chǎn)生和細胞色素C釋放增加,導致細胞凋亡[21]。辣椒素持續(xù)激活TRPV1后,可導致通道脫敏,抑制Ca2+內(nèi)流[22]。TRPV1激活促進鈣超載和TRPV1激動劑辣椒素抑制鈣超載這二者之間的矛盾,目前更多學者認為辣椒素抑制鈣超載主要是由TRPV1脫敏所致[23]。

2.2 興奮性毒性 谷氨酸是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中主要的興奮性神經(jīng)遞質(zhì),介導興奮性突觸傳遞,過高的谷氨酸水平可引發(fā)興奮性毒性,導致中風后神經(jīng)元死亡[24]。鈣超載與興奮性毒性相互影響,中風后鈣超載引起神經(jīng)元去極化,釋放谷氨酸,持續(xù)激活突觸后NMDA受體等谷氨酸受體,導致Ca2+內(nèi)流再次增加,形成細胞內(nèi)Ca2+升高與谷氨酸異常釋放的惡性循環(huán)[16]。IS后遲發(fā)性細胞死亡與經(jīng)NMDA受體內(nèi)流的Ca2+誘發(fā)的興奮性毒性密切相關(guān)[25]。辣椒素不僅可調(diào)節(jié)谷氨酸釋放,還可調(diào)節(jié)NMDA受體谷氨酸受體的表達,緩解IS后興奮性氨基酸毒性損傷。大鼠大腦中動脈閉塞(Middle Cerebral Artery Occlusion,MCAO)手術(shù)前3 h腹腔注射辣椒素(0.2 mg/kg),24 h進行氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(Gas Chromatography-mass Spectrometry,GC-MS)代謝組檢測,發(fā)現(xiàn)辣椒素預處理后皮質(zhì)谷氨酸恢復至正常水平,推測辣椒素通過降低興奮性氨基酸的釋放發(fā)揮神經(jīng)保護作用[26]。在培養(yǎng)的大鼠皮層神經(jīng)元中,不同劑量的辣椒素(3 μmol/L、10 μmol/L)預處理30 min可以抑制谷氨酸誘導的興奮性毒性。辣椒素處理0.5 h后可降低MCAO大鼠大腦梗死周圍區(qū)NMDA受體亞基GluN1的蛋白豐度,60 min后降低GluN2B的蛋白豐度,保護大腦皮質(zhì)神經(jīng)元免于興奮性毒性損傷[20]。TRPV1基因敲除小鼠中,辣椒素抑制谷氨酸誘導的興奮性毒性的作用消失,提示辣椒素依賴TRPV1機制來抑制興奮性毒性。

2.3 神經(jīng)炎癥 中風后繼發(fā)的神經(jīng)炎癥可導致細胞死亡。源自于免疫介質(zhì)的促炎信號激活小膠質(zhì)細胞、星形膠質(zhì)細胞等腦固有免疫細胞,釋放白細胞介素-1(Interieukin-1,IL-1)、腫瘤壞死因子-α(Tumor Necrosis Factor-α,TNF-α)等炎癥介質(zhì)導致炎癥反應(yīng)損傷,并促進其他炎癥細胞向缺血區(qū)域浸潤,加劇腦損傷[27]。小膠質(zhì)細胞同時也分泌IL-10等抗炎因子發(fā)揮保護作用[28]。側(cè)腦室注射辣椒平可抑制磷酸化c-Jun氨基末端激酶(p-c-Jun N-terminal Kinase,p-JNK)和磷酸化p38促分裂原活化的蛋白激酶(p38 Mitogenactivated Protein Kinase,p-p38MAPK)表達[29],抑制TRPV1,降低MCAO小鼠IL-1β的表達并減少杏仁核小膠質(zhì)細胞的激活,減輕炎癥反應(yīng)[30]。TRPV1拮抗劑AMG517和AMG9810可降低IS后血清TNF-α水平,提高血清IL-10水平,減少IS后炎癥反應(yīng),抑制神經(jīng)元死亡,降低腦梗死體積[31-32]。AMG9810還可通過抑制梗死周圍區(qū)域Toll樣受體2和Toll樣受體4的mRNA表達,緩解神經(jīng)功能障礙[33]。核因子κB、p38MAPK與JNK信號通路參與神經(jīng)炎癥并導致不同程度的缺血后神經(jīng)損傷。電針預處理降低MCAO大鼠神經(jīng)元TRPV1的表達,抑制核因子κB轉(zhuǎn)錄活性和p38MAPK激活,抑制氧化應(yīng)激損傷、降低炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生[34-35],這些研究都提示TRPV1與神經(jīng)炎癥之間存在正相關(guān),即激活TRPV1可促進神經(jīng)炎癥;抑制TRPV1可減輕神經(jīng)炎癥,實現(xiàn)神經(jīng)保護作用。但有研究報告短暫性大腦中動脈阻塞(Transient Middle Cerebral Artery Occlusion,tMCAO)大鼠灌胃50 mg/kg、100 mg/kg辣椒素可增加海馬組織TRPV1表達,減少TNF-α、IL-1β分泌,通過MAPK/環(huán)氧合酶-2(Cyclooxygenase,COX-2)信號通路抑制小膠質(zhì)細胞的過度活化[36]。但辣椒素減少炎癥介質(zhì)分泌是否依賴TRPV1機制尚需要進一步驗證。

2.4 自噬 IS發(fā)生后神經(jīng)元、膠質(zhì)細胞及腦內(nèi)皮細胞均可發(fā)生自噬,清除受損的細胞器及蛋白質(zhì),但不足或過度的自噬可破壞細胞穩(wěn)態(tài),導致細胞死亡[37]。一方面TRPV1促進自噬,消除自噬不足狀態(tài),達到神經(jīng)保護作用。TRPV1激動劑辣椒素可通過促進氧糖剝奪/復氧(Oxygen-glucose Deprivation/Re-oxygenation,OGD/R)小膠質(zhì)細胞自噬,降低缺血再灌注損傷導致的小膠質(zhì)細胞炎癥損傷[38],TRPV1抑制劑iRTX則拮抗OGD/R小膠質(zhì)細胞自噬,加重氧化應(yīng)激誘導的小膠質(zhì)細胞凋亡[39]。另一方面,當自噬過度激活時,可通過抑制TRPV1發(fā)揮神經(jīng)保護作用。辣椒平可下調(diào)小鼠腦杏仁核區(qū)自噬相關(guān)蛋白Beclin-1和微管相關(guān)蛋白輕鏈3(Light Chain Protein 3,LC3),并可能通過激活調(diào)控自噬的主要信號通路磷脂酰肌醇3激酶(Phosphoinositide 3-kinase,PI3K)/蛋白激酶B(Protein Kinase B,AKT)/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(Mammalian Target of Rapamycin,mTOR)通路,抑制自噬的過度激活,發(fā)揮神經(jīng)保護作用[40]。

2.5 腦血流 IS后缺血再灌注損傷導致血管收縮和擴張的物質(zhì)釋放失衡,內(nèi)皮素、血管緊張素Ⅱ、血栓素A2等縮血管物質(zhì)大量釋放,一氧化氮、前列環(huán)素等擴血管物質(zhì)釋放減少,導致微血管收縮-舒張功能失調(diào)。內(nèi)皮型一氧化氮合酶(Endothelial Nitric Oxide Synthase,eNOS)在腦血流維持和中風預防中具有顯著作用,辣椒素激活蛋白激酶A,促進eNOS磷酸化,改善腦基底動脈內(nèi)皮依賴性血管舒張功能,擴張腦動脈,延緩中風的發(fā)生[14]。腦缺血會損害大腦中動脈的肌源性反應(yīng),辣椒素預處理可改善大腦中動脈遠端肌源性張力,降低梗死體積[41-42]。辣椒素可通過增加大腦中動脈平均血流速度,降低搏動指數(shù),產(chǎn)生與蝶腭神經(jīng)節(jié)電刺激類似的增強側(cè)支血流作用[43]。因此,TRPV1能夠改善血管動力學,維持腦組織血液循環(huán),促進側(cè)支循環(huán),調(diào)節(jié)腦血流。此外,TRPV1對血腦屏障不利,TRPV1拮抗劑辣椒平可緩解缺血再灌注后血腦屏障通透性的改變,保護血腦屏障[44]。

2.6 保護性低溫 低溫可降低需氧量、保障貯能、提高細胞存活率,不同程度地促進神經(jīng)系統(tǒng)新陳代謝與神經(jīng)遞質(zhì)釋放,被認為是腦缺血缺氧損傷頗具價值的神經(jīng)保護療法[45]。TRPV1通道可調(diào)節(jié)體溫,保護缺血缺氧腦組織。二氫辣椒堿(Dihydrocapsaicin,DHC)激活TRPV1可誘導體溫降低,減輕皮質(zhì)梗死及繼發(fā)產(chǎn)生的丘腦損傷,抑制星形膠質(zhì)細胞增殖,保護神經(jīng)元,并促進IS后遠期神經(jīng)功能的恢復[46]。低劑量DHC聯(lián)合物理降溫可降低ROS,抑制細胞凋亡,減輕神經(jīng)功能障礙,高劑量DHC則沒有表現(xiàn)出神經(jīng)保護作用[45]。TRPV1激動劑Rinvanil激活TRPV1受體同樣可減少tMCAO小鼠O2消耗量,降低體溫,從而減輕缺血性腦損傷[47]。然而,內(nèi)源性TRPV1選擇性激動劑N-油酰多巴胺誘導的低體溫則未觀察到積極的治療作用[48]。不同種類及劑量TRPV1激動劑誘導低溫的神經(jīng)保護作用存在一定差異,可能由于TRPV1受體結(jié)構(gòu)具有復雜性,導致在不同條件下激活TRPV1時可能同時誘導大量細胞內(nèi)Ca2+進入、谷氨酸釋放,產(chǎn)生興奮性毒性和氧化應(yīng)激等有害反應(yīng)。見圖1。

3 TRPV1與中藥

我國中藥普及度高,患者依從性好,潛在受益人群廣泛,中國國家卒中登記結(jié)果顯示,70.6%的IS住院患者使用中醫(yī)藥治療[49]。目前已有多種具有神經(jīng)保護作用的中藥成分被證實為TRPV1的激動劑/抑制劑。

3.1 激動劑 吳茱萸中吳茱萸堿與吳茱萸次堿被發(fā)現(xiàn)可激活TRPV1。吳茱萸堿促進TRPV1通道依賴的星形膠質(zhì)細胞保護性自噬[50];吳茱萸次堿激活DRG中的TRPV1,增加降鈣素基因相關(guān)肽(Calcitonin Generelated Peptide,CGRP)的表達,降低血壓[51]。生姜主要成分6-姜酚通過促進TRPV1/FAF1復合物解離介導的自噬抑制核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白3(Nucleotide-binding Oligomerization Domain-like Receptor Protein 3,NLRP3)炎癥小體和凋亡[52]。羌活水提物及醇提物中均含有TRPV1激動劑,通過激活TRPV1發(fā)揮作用[53]。此外,胡椒堿與大蒜素均對TRPV1有激活作用,并能對抗缺血性腦損傷[54-57]。臨床IS常用藥全蝎與蜈蚣被發(fā)現(xiàn)可激活TRPV1,但其抗缺血腦損傷作用是否依賴TRPV1機制需要深入探究[58-60]。見表1。

表1 中藥TRPV1激動劑在IS中的作用

3.2 抑制劑 TRPV1抑制劑中亦具有神經(jīng)保護作用。天然冰片可下調(diào)海馬CA1、CA3區(qū)中TRPV1的表達,促進神經(jīng)遞質(zhì)γ-氨基丁酸的釋放,減少海馬神經(jīng)元的損傷[61]。龍血竭中的劍葉龍血素A、B,可通過拮抗TRPV1減輕興奮性谷氨酸毒性,保護血腦屏障功能,抑制神經(jīng)細胞凋亡[62]。牡荊素通過抑制TRPV1受體的過度激活,減少缺血缺氧性腦損傷新生小鼠腦梗死的體積[63]。黃芩苷及大黃素在體外均可下調(diào)DRG神經(jīng)元中TRPV1 mRNA的表達水平并抑制細胞內(nèi)Ca2+水平升高[64-65]。枇杷葉提取物及其有效成分熊果酸可抑制辣椒素誘導TRPV1穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞中的Ca2+內(nèi)流[66]。葛根素可抑制DRG中TRPV1表達,抑制神經(jīng)性疼痛[67]。此外,中藥大黃、黃連,中藥成分川芎嗪、阿魏酸、芍藥苷均可抑制TRPV1[68-72]。見表2。

表2 中藥TRPV1抑制劑在IS中的作用

4 小結(jié)

TRPV1作為TRP家族中的一類非選擇性陽離子通道,主要轉(zhuǎn)運Ca2+和Na+。激活TRPV1后脫敏,可抑制谷氨酸誘導的鈣超載及興奮性毒性,抑制TRPV1則可緩解神經(jīng)炎癥。TRPV1激活還可促進自噬發(fā)生,在機體自噬不足時發(fā)揮神經(jīng)保護作用。此外,激活TRPV1可維持腦血流,誘導保護性低溫,降低腦組織缺血損傷。TRPV1的多途徑調(diào)控作用為IS新藥的研發(fā)提供新思路。

5 討論

自辣椒素受體成功克隆以及冷凍電鏡解析其結(jié)構(gòu)后,靶向TRPV1的研究成為全世界關(guān)注的熱點。TRPV1具有一個顯著性特征：脫敏,包括急性脫敏和快速脫敏[81]。急性脫敏即隨著激動劑刺激時間的延長,誘發(fā)的TRPV1電流振幅不斷減小;快速脫敏即指重復、短時間使用激動劑刺激,TRPV1電流振幅逐漸減小。脫敏與細胞內(nèi)Ca2+水平變化密切相關(guān)[81]。TRPV1脫敏特性被認為是其發(fā)揮神經(jīng)保護作用的重要策略[23,82]。辣椒素結(jié)合在蛋白的細胞內(nèi)側(cè)位置以激活TRPV1通道。

目前的研究支撐辣椒素依賴TRPV1機制來抑制谷氨酸誘導的鈣超載及下調(diào)NMDA的表達,抑制興奮性毒性,極有可能由TRPV1脫敏所致[23]。其次,激活TRPV1具有促炎作用,抑制TRPV1可降低神經(jīng)炎癥[32]。另外,TRPV1促進自噬,這個功能是否發(fā)揮神經(jīng)保護作用取決于機體狀態(tài),當機體自噬不足時,激活TRPV1發(fā)揮保護作用[38]。當自噬過度激活,則抑制TRPV1發(fā)揮抗缺血損傷作用[40]。此外,激活TRPV1誘導Ca2+內(nèi)流引起eNOS的磷酸化從而誘導NOS產(chǎn)生和促進CGRP的釋放被認為是引起血管舒張的2條重要途徑。TRPV1還能夠促進側(cè)支循環(huán)維持腦血流,誘導保護性低溫,發(fā)揮神經(jīng)保護作用[42,45]。總之,激動TRPV1并不能一直發(fā)揮神經(jīng)保護作用。因此,臨床在選擇TRPV1相關(guān)藥物時應(yīng)該緊密結(jié)合病理狀態(tài)。同時TRPV1激動劑可增加血腦屏障的通透性,可能增加出血風險,對于腦出血患者需謹慎使用[83]。

另外,TRPV1可預防中風的發(fā)生。有研究表明激活TRPV1能減少泡沫細胞的形成,抑制中風危險因素動脈粥樣硬化,延遲易卒中型自發(fā)性高血壓大鼠中風發(fā)作,延長生存時間[14,84]。近年來,越來越多的臨床研究認為辣椒素在中風后遺癥期具備良好的應(yīng)用前景[85-86]。目前已有大量可作用于TRPV1受體的藥物被證實具有潛在的神經(jīng)保護作用,靶向TRPV1已然成為IS藥物研發(fā)的新策略。

利益沖突聲明：無。