HPLC法同時測定保健食品中9種降糖藥物的含量

于文萃

近年來，隨著人們養(yǎng)生保健觀念的逐漸加強，一些宣稱可以輔助調(diào)節(jié)血糖的保健食品越來越受到老年人尤其是老年糖尿病患者的青睞，據(jù)文獻(xiàn)[1-3]報道，有商家在產(chǎn)品中非法添加化學(xué)降糖藥以達(dá)到令患者滿意的降糖效果，導(dǎo)致患者放棄了藥物治療，長期服用該類產(chǎn)品將嚴(yán)重威脅糖尿病患者的健康。檢出非法摻入化學(xué)降糖藥最權(quán)威的方法是高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用[4-5]技術(shù)，但該方法設(shè)備費用昂貴，一定程度上限制了在基層檢驗單位的使用。本研究為了使基層檢驗單位也可以及時準(zhǔn)確地篩查保健食品的藥物添加問題，更快、更簡便地確定降糖類保健食品中是否摻入了化學(xué)降糖藥物的成分，節(jié)約檢測時間和成本，建立了使用高效液相色譜-紫外檢測器法同時檢測9種化學(xué)降糖藥物含量的方法，檢測品種涵蓋了目前上市的磺酰脲類、非磺酰脲類、噻唑脘二酮類等主要降糖類化學(xué)藥物，該方法準(zhǔn)確，簡便，可操作性強，適用于降糖類保健食品非法添加降糖藥物成分的篩查。現(xiàn)報告如下：

1 資料與方法

1.1 一般資料 本研究立項時間為2022年初，于2022年底完成。研究重點是對我市在售降糖類保健食品中是否添加降糖藥物進(jìn)行篩查，以保障我市人民群眾的用藥安全。本研究所用樣品均為我市各保健食品銷售商店在售的宣稱具有降糖類保健功能的19個廠家生產(chǎn)的19個批次保健產(chǎn)品。

1.2 儀器與試藥

1.2.1 儀器 島津LC-20AT高效液相色譜系統(tǒng)，島津SPD-20A（UV-Vis Detector），島津Labsolution色譜工作站。

1.2.2 試藥 對照品：格列本脲（批號：100135-201806），格列齊特（批號：100269-201505），格列喹酮（批號：100280-201403），格列吡嗪（批號：100281-201604），格列美脲（批號：100674-201904），那格列奈（批號：100619-201702），瑞格列奈（批號：100753-201303），鹽酸吡格列酮（批號：100634-202104），鹽酸羅格列酮（批號：100673-201902）以上均由中國藥品生物制品檢定研究院提供。取供試品為輔助降糖類保健食品19批（均為市售），水為純化水，乙腈為色譜純，冰醋酸、乙酸銨為分析純。

1.3 方法

1.3.1 對照品溶液的制備 精密稱取格列本脲對照品10.81 mg，格列齊特對照品10.12 mg，格列喹酮對照品10.89 mg，格列吡嗪對照品10.34 mg，格列美脲對照品10.34 mg，那格列奈對照品10.72 mg，瑞格列奈對照品10.47 mg，鹽酸吡格列酮對照品10.21 mg，鹽酸羅格列酮對照品10.98 mg，分別置于10 mL的量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為對照品儲備液。分別精密量取格列本脲，格列齊特，格列喹酮，格列吡嗪，格列美脲，那格列奈，瑞格列奈，鹽酸吡格列酮，鹽酸羅格列酮對照品溶液各5 mL，置同一50 mL量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，制成混合對照品溶液。

1.3.2 供試品溶液的制備 精密稱取供試品約1.5 g，置100 mL錐形瓶中，精密加入甲醇溶液25 mL，超聲提取30 min（功率125 W，頻率53 kHz），濾過，殘渣用少量甲醇洗滌3次，合并濾液于50 mL容量瓶中，用甲醇溶液稀釋至刻度，即得。

1.3.3 色譜條件及系統(tǒng)適用性實驗 迪馬Diamonsil C18色譜柱；以0.1%冰醋酸-0.01 mol/L乙酸銨水溶液-乙腈（53：47）為流動相；柱溫為35 ℃；進(jìn)樣量10 μL；流速為1.0 mL·min-1；檢測波長為210 nm。混合對照品色譜圖（見圖1）。在該色譜條件下，理論塔板數(shù)分別按格列吡嗪、那格列奈、鹽酸羅格列酮、鹽酸吡格列酮、格列齊特、格列本脲、格列美脲、格列喹酮、瑞格列奈峰計算均不低于10000，分離度均符合《中國藥典》2020年版要求。

圖1 混合對照品HPLC色譜圖

1.4 方法學(xué)考察

1.4.1 線性范圍 精密量取1.3.1項下的混合對照品溶液2 μL、5 μL、10 μL、20 μL、40 μL分別注入液相色譜儀，按照1.3.3項下的色譜條件進(jìn)行測定，以峰面積（Y）為縱坐標(biāo)，質(zhì)量濃度（X）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，經(jīng)回歸分析，格列吡嗪質(zhì)量濃度在22.68～413.60 μg·mL-1，那格列奈在21.44～428.80 μg·mL-1，鹽酸羅格列酮在21.96～439.20 μg·mL-1，鹽酸吡格列酮在20.42～408.40 μg·mL-1，格列齊特在20.24～404.80 μg·mL-1，格列本脲在21.62～432.40 μg·mL-1，格列美脲在20.68～413.60 μg·mL-1，格列喹酮在21.78～435.60 μg·mL-1，瑞格列奈在20.94～ 418.80 μg·mL-1范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系，r≥0.9998，回歸方程見表1。

表1 9種降糖藥物的回歸方程與線性范圍（n=5）

1.4.2 精密度實驗 精密吸取同一混合對照品溶液10 μL，按照1.3.3項下色譜條件，重復(fù)進(jìn)樣6次，記錄色譜圖，9種降糖藥物各自峰面積的RSD值范圍為0.3%～0.8%（n=6）。

1.4.3 穩(wěn)定性實驗 按1.3.1項下的方法制備混合對照品溶液，按照1.3.3項下色譜條件，分別于0，2，4，8，12，16和24 h進(jìn)行測定，記錄色譜圖，9種降糖藥物各自峰面積的RSD值范圍為0.5%～0.7%（n=7）。

1.4.4 檢出限和定量限 精密量取1.3.1項下混合對照品溶液，使用微量取樣器精確稀釋制備不同濃度的系列溶液，分別注入液相色譜，按照1.3.3項下的色譜條件測定，記錄色譜圖，按信噪比（S/N）為3時，確定檢出限，信噪比（S/N）為10時，確定定量限，檢出限和定量限結(jié)果見表2。9種降糖藥物的檢出限濃度范圍為0.03～0.4 μg·mL-1，定量限濃度范圍為0.1～1.1 μg·mL-1。

表2 9種降糖藥物的檢出限和定量限結(jié)果

1.4.5 回收率試驗 在空白降糖保健食品供試品溶液中精確加入降糖藥物對照品溶液，配成低、中、高3個濃度的加樣標(biāo)準(zhǔn)品樣品，考察9種降糖藥物成分在降糖保健食品中的回收率。結(jié)果見表3。

表3 9種降糖藥物的回收率結(jié)果（n=6）

2 結(jié) 果

取供試品為19個生產(chǎn)廠家共計19個批次的輔助降糖類保健食品，按1.3.2的方法制備供試品溶液，按照1.3.3項下的色譜條件進(jìn)行測定，記錄色譜圖，以外標(biāo)法按峰面積計算含量。與對照品檢測結(jié)果對照，結(jié)果顯示19個批次的供試品，均未檢出磺酰脲類、非磺酰脲類、噻唑脘二酮類等9種降糖藥物的非法添加，證明檢測方法有效。

3 討 論

輔助降糖類保健食品是具有保健功能或者以補充營養(yǎng)物質(zhì)為目的的食品，適宜于特定人群食用，具有調(diào)節(jié)機體功能，不以治療疾病為目的，并且是對人體不產(chǎn)生任何急性、亞急性或慢性危害的食品，正因為保健食品被定義為食品的一個種類，所以在人們的印象中保健食品會比藥品安全，但目前市場上在售降糖類保健食品中個別存在添加降糖藥物的現(xiàn)象，對老年朋友或者糖尿病患者來說，服用這種添加降糖藥物的保健食品會比直接服用降糖藥物后果嚴(yán)重，因為降糖藥物會明確指明適用人群、服用劑量、不良反應(yīng)以及注意事項等等[6-7]，而添加降糖藥物的保健食品則屬于違法行為，其沒有明確地標(biāo)出添加的是何種藥物以及添加的劑量，長期服用會產(chǎn)生嚴(yán)重的后果甚至危及生命，因此有必要進(jìn)行添加劑檢測并需要研究保健食品中非法添加藥品的篩查方法[8]，為市場監(jiān)管部門監(jiān)管保健食品中的非法添加行為提供技術(shù)支持，為人民群眾追求健康的需求提供安全保障。

高效液相色譜-質(zhì)譜（液質(zhì)）聯(lián)用技術(shù)是采用質(zhì)譜作為定性定量分析的檢測器，利用分離物質(zhì)的分子量進(jìn)行定性分析，由于質(zhì)譜儀器價格昂貴，維護(hù)保養(yǎng)成本也高，一般的基層檢驗單位不具備這種儀器，采用反相高效液相色譜法，利用已知降糖藥物的對照品進(jìn)行外標(biāo)法定性定量分析也可以達(dá)到液質(zhì)聯(lián)用檢測的效果，而且該方法設(shè)備簡便，維護(hù)保養(yǎng)費用較低，基層的檢驗單位普遍配備，所以建立高效液相色譜-紫外檢測器的分離分析方法有助于基層檢驗單位對相關(guān)保健食品進(jìn)行及時準(zhǔn)確的篩查。

本文將臨床常用的磺酰脲類、非磺酰脲類、噻唑脘二酮類等9種降糖藥物采用高效液相色譜的方法同時進(jìn)行分離，分離度符合相關(guān)要求且峰型良好。同時我們也考察了不同品牌的色譜柱，分離重現(xiàn)性良好。該方法準(zhǔn)確、簡便、可操作性強，適用于篩查降糖類保健食品中磺酰脲類、非磺酰脲類、噻唑脘二酮類等9種降糖藥物的非法添加。