云南玉溪煙區煙草黑脛病菌的生理小種鑒定及其致病性分析

劉迎龍，王軍偉，陸俊平，何鵬搏，何鵬飛，盧燦華，李鵬強，吳毅歆，孔寶華，田陽陽*，何月秋*

1. 云南省云南農業大學生物資源保護與利用國家重點實驗室，昆明市盤龍區灃源路452 號 650201

2. 紅塔煙草（集團）有限責任公司，云南省玉溪市紅塔區紅塔大道118 號 653100

3. 云南省煙草農業科學院，昆明市五華區圓通街33 號 650021

由煙草疫霉菌（Phytophthora parasiticavar.nicotianae）引起的煙草黑脛病（Tobacco black shank）是一種毀滅性的土傳病害，嚴重影響煙葉生產的發展［1］。同時，隨著全球氣候的變暖，單一品種大面積種植以及病原菌的抗藥性增加和致病力增強等原因，導致煙草黑脛病發生面積和嚴重程度增大，影響了特色優質煙葉的穩定供給［2］。煙草黑脛病菌存在生理小種分化現象，既是其對寄主植物和環境適應的表現，也是此類病害難以有效防治的原因之一。煙草疫霉菌不同生理小種是在特定鑒定品種上的不同致病型［3］。迄今為止，世界范圍內已報道的煙草黑脛病菌有4 個生理小種，其中美國已發現0、1、2 和3 號生理小種，非洲發現2 號生理小種［4-6］。我國云南、四川、湖北和河南等產區先后發現了0號和1 號生理小種［7-11］。煙草黑脛病的綜合防治主要以種植抗病品種為主，但煙草疫霉菌新的生理小種或高毒力菌系的出現往往使一批抗病品種（尤其是具有單基因控制的垂直抗性品種）喪失抗病性而成為感病品種，造成病害的大流行［12-14］。因此，鑒定煙草疫霉菌的生理小種，明確植煙區黑脛病菌種群結構及致病力的差異對控制煙草黑脛病具有重要意義。而目前采用鑒別寄主活體植株的抗感反應來鑒定生理小種雖然結果可靠，但耗時耗力，溫室幼苗或田間苗圃接種約需2 月以上，而其他替代方法如TTC 法僅能根據顏色反應區分0 號或1 號生理小種和其他生理小種具有明顯局限性［15］。另外，組培苗接種法雖然能快速獲得長勢一致且無病原菌的寄主材料，但培養室環境沒有寄主的生境復雜，致使鑒別的準確率降低［16］。因此，需要尋求一種高效的煙草黑脛病菌生理小種鑒定方法。有研究表明，云南玉溪市煙區黑脛病菌的遺傳分化差異小，具有高度同源性［17］，但對于該地區黑脛病菌生理小種歸屬及對主栽品種的致病性差異并不明確。為此，對云南玉溪煙區黑脛病菌種群結構和致病力差異，以及生理小種鑒別方法進行了研究，旨在為明確該地區病原菌的特性、指導煙葉栽培品種合理布局及科學防控煙草黑脛病提供依據。

1 材料與方法

1.1 煙草疫霉菌的分離及培養

于2020 年6 月—2021 年10 月在云南省玉溪市新平縣和澄江市煙草種植區采集煙草黑脛病病株及根際土壤各200 余份，參考本實驗室設計的卵菌選擇性培養基分離病原物［18］。即以燕麥培養基（Oat Meal Agar，OMA）為基礎培養基，滅菌后加入以下成分混勻制成培養基平板：利福平［98%，生工生物工程（上海）股份有限公司］25~75 mg/L、氨芐青霉素（98%，北京索萊寶科技有限公司）50~100 mg/L、制霉菌素（4 400 units/mg，上海麥克林生化科技有限公司）25~75 mg/L、惡霉靈（AS，總有效成分含量30%，四川國光農化股份有限公司）50~100 mg/L、五氯硝基苯［98%，阿拉丁試劑（上海）有限公司］75~150 mg/L 和甲硫·戊唑醇（SC，總有效成分含量為41%，甲基硫菌靈34.2%，戊唑醇6.8%，江蘇龍燈化學有限公司）25~75 mg/L，培養基pH 6.8~7.2。分離培養3~5 d后純化疑似菌落，之后根據煙草疫霉菌外觀形態鑒定并參考柯赫氏法則［19］驗證后確認病原物，以燕麥培養基中于28 ℃培養。

1.2 煙草疫霉菌生理小種的TTC法鑒定

TTC（2,3,5-氯化三苯基四氮唑）溶于水中為無色溶液，當與菌株產生的脫氫酶發生氧化還原反應時，生成紅色產物三苯基甲臜（TTF），煙草疫霉菌0號、1號生理小種脫氫酶可以使TTC還原，培養基變成品紅色［9，15］。因此，利用0.05%（質量體積分數）TTC的燕麥培養基平板可鑒定煙草疫霉菌株的0號和1 號生理小種［15］。具體操作：于燕麥平板上活化培養供試菌株，以無菌7 mm 打孔器取菌餅，菌絲面朝下倒置于含TTC 的燕麥培養基平板中央，同時接種至不含TTC 的燕麥平板上作為對照，每個供試菌株重復3 個平板。于28 ℃溫箱中黑暗培養3~5 d，期間觀察菌落變化和顏色反應，最終統計并拍照記錄。

1.3 煙草疫霉菌生理小種鑒別寄主的活體接種鑒定

參考煙草疫霉菌生理小種鑒定方法［9，20-22］，選擇皺葉煙草（Nicotiana plumbaginifolia）、裸莖煙草（Nicotiana nudicaulis）、NC1071（G43）、Florida 301（XJ1002）、小黃金1025 和L8（BWS10）［3，23-24］6 個抗、感明顯的鑒別寄主，以活體植株接種的方式對供試煙草疫霉菌株生理小種進行鑒定。預先將上述鑒別寄主的煙草種子催芽后播種至穴盤內，置于15~28 ℃的育苗棚內培養約30~50 d 后移栽至小花盆（直徑×高度=12 cm×13 cm）中，并于室外還苗1周后備用。供試菌株提前于燕麥平板上活化培養，待菌絲長滿培養皿后移入光照培養箱內（3 000 lx 光照/黑暗各12 h）誘導其產生孢子囊，3 d后取出，用滅菌牙簽刮取表面菌絲，并于小型榨汁機（JYL-C93T 九陽豆漿機，九陽股份有限公司）內加入100 mL 無菌水將菌絲體打碎，破碎時間持續15 s，雙層紗布過濾后取濾液于血球計數板上計數游動孢子，并調整孢子濃度至1×106個/mL。接種時先將上述6 個鑒別寄主煙苗進行致傷處理，即用無菌手術刀對其莖基部縱向劃一長約8~10 mm，深約2~3 mm 傷口（以刺入煙苗髓部為宜）。致傷后立即對傷口處注射500 μL 上述供試菌株孢子液，以注射等量無菌水作為對照，每個供試菌株對應的鑒別寄主分別處理3 株煙苗作為重復。煙苗管理一致，按照標準方法進行病害調查及抗性評價［25-26］，并根據鑒別寄主反應判斷供試煙草疫霉菌的生理小種類型。

1.4 主栽品種的致病性分析

與活體植株接種鑒別生理小種方法一致，以主栽品種云煙87、K326和KRK26 作為接種對象，測定供試菌株對主栽品種的致病性。

1.5 煙草疫霉菌生理小種的離體材料鑒定

根據TTC 法及鑒別寄主鑒定結果，選擇煙草疫霉菌0 號和1 號的生理小種各3 株，采用6 個鑒別寄主和3 個主栽品種的離體材料鑒定各生理小種的致病性。待煙苗長至4 葉期，采集葉片和莖稈進行致傷（葉片與莖稈均用無菌牙簽扎一小孔，莖稈傷口深約1~3 mm）和未致傷處理后保濕培養，同時用打孔器在燕麥培養基平板上取7 mm 不同生理小種的煙草疫霉菌絲塊，菌絲面朝下貼至接種材料的表面，同時接種無菌燕麥瓊脂塊作為對照，同一接種材料設置3次重復，定期觀察并記錄發病狀況。

1.6 數據處理

采用IBM SPSS Statistics 27軟件統計試驗數據的平均值并進行方差分析，采用Duncan’s 法進行數據間差異的顯著性（P＜0.05）檢驗。使用Microsoft Excel 2016軟件進行表格制作及圖像處理。

2 結果與分析

2.1 煙草疫霉菌的分離鑒定

分離物在燕麥培養基平板上長勢良好，菌落白色，菌絲無隔，無色透明，質地較緊密，孢子囊呈檸檬型，具乳突狀孢囊孔，內含未成熟的游動孢子泡狀顆粒。用分離物菌絲塊接種健康的KRK26 離體葉片1~3 d后即可看到黃棕色水漬狀病斑，隨后接種部位腐爛發黑。取發病部位的菌絲體鏡檢觀察，可見大量檸檬型具乳突狀的孢子囊。通過選擇性培養基分離及柯赫氏法則驗證后獲得172 株煙草疫霉菌。其中，新平縣平甸鄉69株，新化鄉15株，澄江市右所鎮88株。

2.2 煙草疫霉菌生理小種的TTC法鑒定

供試的172個煙草疫霉菌株在TTC培養基平板上菌落呈品紅色，而不含TTC 的燕麥培養基平板上，菌落呈白色，顏色差異明顯，見圖1。即所鑒定的煙草疫霉菌屬于0號或1號生理小種。

圖1 TTC平板上煙草疫霉菌的顯色反應Fig.1 Color reaction of P.parasitica var.nicotianae on TTC plate

2.3 煙草疫霉菌生理小種的鑒別寄主鑒定

鑒別寄主對煙草疫霉菌不同生理小種具有不同的抗感反應型［10，15，27］。172個菌株可分為0號生理小種149 株，占比86.63%；1 號生理小種12 株，占比6.98%；無致病力的有2 株（對主栽品種也無致病力），占比1.16%；另有9株對鑒別寄主的致病反應無規律，無法鑒定其生理小種類型，占比5.23%。對于新平縣平甸鄉、新化鄉和澄江市右所鎮種植區而言，平甸鄉與右所鎮種植區均有0、1號生理小種和其他類型菌株，而新化鄉種植區僅有0號生理小種，未見其他類型菌株，見表1。因此，云南玉溪煙區煙草黑脛病菌以0號生理小種為優勢種群。

表1 云南玉溪新平縣和澄江市煙區煙草疫霉菌生理小種菌株數量和占比Tab.1 Number and percentage of physiological races of P.parasitica var.nicotianae in tobacco-growing areas of Xinping County and Chengjiang City

2.4 黑脛病菌對主栽品種的致病性

根據采樣點的地理分布及菌株來源，按鄉鎮歸類分析各產區煙草黑脛病菌對3個主栽品種的致病性差異。以病情指數為依據，比較單個品種感病反應，來源于不同種植區的煙草疫霉菌對品種KRK26、K326 和云煙87 的致病性差異均不顯著，3個煙草品種K326、云煙87、KRK26 病情依次加重。其中，K326 的病情指數為47.16~49.76，低于云煙87與KRK26。致病性測定結果表明，170 個菌株對主栽品種KRK26、云煙87和K326均有較強致病力，但病菌在這3個主栽品種上的致病性與來源地之間關系不密切，見圖2。

圖2 供試煙草疫霉菌對主栽品種的致病性差異Fig.2 Pathogenicity difference of tested P.parasitica var.nicotianae to main tobacco cultivars

2.5 離體葉片和離體莖稈煙草疫霉菌生理小種的接種鑒定

鑒別寄主中，由于皺葉煙草長勢較弱，葉片和莖稈材料較少，不適宜采集；NC1071（G43）抗感性狀不夠分明，穩定性較差；主栽品種云煙87 和KRK26 較感病，因此這些品種均不適合作為離體材料，而以Florida 301、K326、裸莖煙草（N.nudicaulis）、L8 及小黃金1025作為鑒別品種進行試驗。離體葉片致傷接種后3 d，各處理均有不同程度的發病，其發病癥狀主要表現為初期葉片呈現暗綠色水漬狀病斑，隨后迅速擴散，后期出現黑褐色潰爛病斑，有的出現白色霉層。煙草疫霉菌0 號小種與1 號小種接種的葉片癥狀差異較大。其中，品種Florida 301均未發病；品種K326、裸莖煙草和L8接種0號生理小種后均未發病，接種1號生理小種后品種K326發病稍輕，病斑形成一水漬狀暈圈，裸莖煙草與L8 發病稍重，病斑呈發黑腐爛狀；品種小黃金1025 對于兩者均表現為感病，接種后葉片發病較重，病斑呈黃棕色，見圖3。

圖3 煙草離體葉片致傷后接種0號和1號生理小種的發病癥狀Fig.3 Symptoms of in vitro injured tobacco leaves after inoculation with physiological races 0 and 1

離體莖稈嘗試莖端橫切面處、縱切于剖面處以及莖稈中部致傷或不致傷接種等方法。其中，莖端橫切面和縱切剖面處傷口較大，接種后3~5 d莖稈發病腐爛較快，即使抗性品種Florida 301和K326也發病嚴重，無法區分0 號和1 號生理小種的致病性差異；莖稈中部未致傷接種后7 d 均未見明顯發病，而經過致傷接種后7 d各品種莖稈對0號和1號生理小種表現出較明顯的抗感反應。其中，品種Florida 301莖稈均未發病，呈現綠色；而品種K326 出現輕微發病，莖稈呈黃褐色水漬狀；裸莖煙草、L8 對0 號生理小種表現為抗病，莖稈呈現綠色，較健康；1號生理小種表現為感病，莖稈呈褐色；而品種小黃金1025對兩者均感病，接種后形成黑色病斑，迅速從接種點向兩端擴展并變褐腐爛，見圖4。

圖4 煙草離體莖稈致傷后接種0號和1號生理小種的發病癥狀Fig.4 Symptoms of in vitro injured tobacco stalks after inoculation with physiological races 0 and 1

3 討論

已有研究表明，云南煙區煙草黑脛病菌生理小種以0 號為主要群體［8，27］。本研究中對玉溪煙區黑脛病菌生理小種鑒定結果顯示，0 號生理小種占86.63%，為該地區的優勢種群，這與前人研究結果相似［7-11］。此外，本研究中將分離到的黑脛病菌接種至該地區主栽品種KRK26、云煙87、K326 活體植株上，抗性較強的品種K326病情指數超過47.16，顯示該地區0 號生理小種對主栽品種具有強致病力。據報道，與1 號生理小種相比，0 號生理小種的煙草疫霉菌基因組中具有更多調控RXLR效應因子的相關基因，導致根莖腐爛的嚴重程度更大，具有更強的致病力；同時，0 號生理小種由于田間潛伏期較短，越冬存活率比1 號小種更高，故具有較強的生態環境適應性［28-29］。因此，這可能是0 號生理小種在該地區具有更大的群體數量的原因。此外，本研究中未鑒別出生理小種歸屬的有9 株，可能與接種環境有關。無致病力的煙草黑脛病菌有2 株，原因可能是由于封存菌種時間較長導致致病力下降；但總體來看，云南玉溪地區煙草黑脛病菌遺傳變異小，致病性分化不明顯。

本研究中嘗試用鑒別寄主離體材料接種病原物鑒定其生理小種，與活體植株根基部致傷注射接種法相比，具有接種材料易得、植株可重復利用、省時高效等優點。在離體材料鑒別中，葉片與莖稈在輕微致傷的條件下對煙草黑脛病菌生理小種的抗感反應與根基部致傷后注射接種法的鑒定結果一致，具有同等的鑒別力，證實了離體材料接種法可用于區分不同煙草品種對煙草疫病的抗感特性。但與根基部致傷注射接種法相比，離體接種的寄主材料發病率略高，病斑更易擴散。這可能與病菌接種離體材料后誘發的抗性不如植株完整，抗性產生的區域較為局限等因素有關［30-31］。而比較兩種材料的抗感反應發現，離體葉片更易發病，因此該方法可能更適合于煙草黑脛病菌致病性接種的快速測定；而莖稈接種則更能反映活體植株的抗感性水平，其抗感反應明顯、結果穩定，可作為活體植株的替代方法。此外，選擇合適的鑒別品種并把握致傷的程度，以及如何以準確判斷離體材料的抗感性等有待進一步深入研究。

云南省玉溪是優質煙葉生產區，主要栽培KRK26、K326 和云煙87 等品質好但不抗病的煙草品種，煙草黑脛病發生風險較大，病原物的廣泛適應性可嚴重威脅寄主的持久抗性。據報道，持續種植感病品種能使原本適應抗性較差品種的病原物再次具有侵染性和強致病力，并導致大面積的病害發生；但將感病品種與抗性較差品種混合種植或輪作可延長抗性一般品種的種植年限，有效降低病害發生風險，最大限度地減少病原菌在種群間轉移，目前該方法也是控制煙草黑脛病的最有效途徑［32-33］。因此，云南玉溪煙區在布局種植品種時應以抗煙草黑脛病菌0 號生理小種的煙草品種為主，同時采用合理的耕作制度與栽培方式來控制煙草黑脛病的發生。

4 結論

采用TTC法及活體植株接種法鑒別煙草黑脛病菌生理小種，發現來源于云南玉溪市新平縣和澄江市的172株煙草疫霉菌屬于0號或1號生理小種，0號生理小種占比86.63%，1 號生理小種占比6.98%；無致病力及未鑒定出小種歸屬的菌株分別占比1.16%和5.23%，新平縣和澄江市煙草黑脛病菌生理小種以0號生理小種為主。致病性測定結果表明，170個菌株對主栽品種KRK26、云煙87 和K326 均具有強致病力。利用寄主離體葉片與莖稈輕微致傷后接種煙草黑脛病菌0和1號生理小種，所呈現的抗感反應與活體植株注射接種結果一致，具有同等的鑒別力，證實了離體材料接種法可用于區分不同煙草品種對煙草黑脛病的抗感性。