煙草黑脛病菌高效殺菌劑的篩選

李彩斌，程云龍，何 軼，彭 宇，李章海，黃衍章，陳方新*

1. 貴州省煙草公司畢節(jié)市公司，貴州省畢節(jié)市七星關(guān)區(qū)貴畢路519 號 551700

2. 作物有害生物綜合治理安徽省重點實驗室 安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，合肥市長江西路130 號 230036

3. 中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)煙草與健康研究中心，合肥市徽州大道1129 號 230052

煙草黑脛病是危害煙草的主要病害之一。引起煙草黑脛病的病原菌為寄生疫霉煙草變種（Phytophthora parasiticavar.nicotiana），該病菌侵染煙株根部和莖基部后，可迅速蔓延至維管束，破壞維管束的結(jié)構(gòu)和功能，造成煙株枯萎，影響煙葉的產(chǎn)量和品質(zhì)［1-3］。煙草黑脛病在煙草各生育期均可發(fā)生，但在成株期尤為嚴(yán)重，可造成煙葉絕收，給煙農(nóng)帶來巨大的經(jīng)濟(jì)損失。該病害分布范圍廣泛，溫帶、熱帶和亞熱帶煙區(qū)均有發(fā)生。我國除黑龍江省外，其他省份植煙區(qū)均有黑脛病發(fā)生，其中貴州、云南、安徽、河南和山東等省發(fā)生較為普遍［4-8］。

煙草黑脛病的防治措施主要有抗病品種的利用、農(nóng)業(yè)防治、生物防治和化學(xué)防治等［9］。目前，施用化學(xué)殺菌劑仍然是防治煙草黑脛病的主要手段，生產(chǎn)上使用的常規(guī)殺菌劑有甲霜靈、烯酰嗎啉和氟嗎啉等。唐旭兵等［10］采用抑菌圈試驗法比較了7種常用殺菌劑對煙草黑脛病菌的抑制作用，結(jié)果表明25%烯酰嗎啉對煙草黑脛病菌具有明顯的抑制作用；蒲小明等［11］分析了氟吡菌胺等6種殺菌劑對煙草黑脛病菌的室內(nèi)毒力，結(jié)果發(fā)現(xiàn)氟吡菌胺的毒力最高，其次是烯酰嗎啉。然而長期、大量、高頻次使用某一種單一藥劑易使病菌產(chǎn)生抗藥性，降低防效［12-15］，故需不斷篩選新的替代防治藥劑。因此，采用菌絲生長速率法分析了22種殺菌劑對煙草黑脛病菌的抑制作用，測定了抑菌效果明顯的7種殺菌劑對煙草黑脛病菌菌絲生長的EC50值，并以烯酰嗎啉和甲霜靈為對照藥劑，通過盆栽試驗分析了雙炔酰菌胺對煙草黑脛病的防治效果，旨在為篩選防治煙草黑脛病的高效殺菌劑提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試菌株與煙草品種

煙草黑脛病菌（Phytophthora parasiticavar.nicotianae）分離自貴州省畢節(jié)市金沙縣煙草病株。供試煙草品種為云煙87，在育苗盤中培育至5 片真葉后備用。

1.2 供試培養(yǎng)基

燕麥瓊脂培養(yǎng)基（OA 培養(yǎng)基）。稱取30 g 燕麥加入1 000 mL 的純水中煮沸4~5 min，用4 層紗布過濾，棄殘渣，留濾液，在濾液中加15 g瓊脂粉，待瓊脂粉完全溶解后，加純水定容至1 000 mL，分裝后高壓蒸汽滅菌備用。

1.3 供試殺菌劑

20%丁吡嗎啉懸浮劑（江蘇耘農(nóng)化工有限公司）、23.4%雙炔酰菌胺懸浮劑（先正達(dá)南通作物保護(hù)有限公司）、50%烯酰嗎啉懸浮劑（巴斯夫植物保護(hù)江蘇有限公司）、20%氟嗎啉可濕性粉劑（沈陽科創(chuàng)化學(xué)品有限公司）、70%代森錳鋅可濕性粉劑（四川潤爾科技有限公司）、1%申嗪霉素懸浮劑（上海農(nóng)樂生物制品股份有限公司）、25%甲霜靈可濕性粉劑（鶴壁市禾盛生物科技有限公司）、20%辛菌胺醋酸鹽水劑（濰坊萬勝生物農(nóng)藥有限公司）、66.5%霜霉威鹽酸鹽水劑（江蘇盛豐生物化工有限公司）、70%丙森鋅可濕性粉劑（拜爾股份有限公司）、25%吡唑醚菌酯懸浮劑（連云港立本作物科技有限公司）、65%代森鋅可濕性粉劑（江蘇利民化工股份有限公司）、80%三乙膦酸鋁可濕性粉劑（江蘇利民化工股份有限公司）、70%噁霉靈可濕性粉劑（青島鑫潤生物科技有限公司）、40%菌核凈可濕性粉劑（江蘇禾盛化工股份有限公司）、50%氯溴異氰尿酸可濕性粉劑（河南銀田精細(xì)化工有限公司）、40%氟硅唑乳油（河北冠龍農(nóng)化有限公司）、70%敵磺鈉可溶性粉劑（山東天威農(nóng)藥有限公司）、50%咪鮮胺錳鹽可濕性粉劑（江蘇輝豐生物農(nóng)藥股份有限公司）、30%噁唑菌酮水分散粒劑（北京華戎生物激素廠）、50%異菌脲懸浮劑（蘇州富美實植物保護(hù)劑有限公司）、20%腐霉利懸浮劑（江西禾益化工股份有限公司）。以上藥劑有效成分含量均為質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

1.4 試驗方法

1.4.1 供試殺菌劑的初篩

參照文獻(xiàn)［16］中的方法，將煙草黑脛病菌轉(zhuǎn)接到OA 培養(yǎng)基平板上活化，5 d 后從菌落邊緣制備菌碟（直徑5.0 mm）備用。將供試的22 種殺菌劑配制成5.0、1.0 和0.5 mg/L 3 個濃度梯度的含藥OA 培養(yǎng)基平板，將菌碟分別接入含不同濃度不同殺菌劑的OA 平板上，置于28 ℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 d 后，采用十字交叉法［17］測量菌落直徑。通過菌絲生長抑制率篩選抑菌效果好的供試殺菌劑。

菌落直徑=測量菌落平均直徑-5.0 mm

菌絲生長抑制率=（對照菌落直徑-處理菌落直徑）/對照菌落直徑×100%

1.4.2 有效殺菌劑的室內(nèi)毒力測定

根據(jù)推薦使用劑量將初篩抑菌效果好的殺菌劑配制成母液。母液按10n進(jìn)行系列稀釋后充分搖勻，配制成5 個濃度梯度。待OA 培養(yǎng)基冷卻至45~50 ℃，將其倒入直徑9 cm滅菌后的培養(yǎng)皿中制成含藥OA 培養(yǎng)基平板，每個濃度設(shè)置4 次重復(fù)，并設(shè)置空白對照。用接種針將預(yù)先制備的菌碟接入含藥OA 培養(yǎng)基平板上，置于28 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 d 后，采用十字交叉法測量菌落直徑。通過菌絲生長抑制率值和各有效藥劑濃度對數(shù)值之間的線性回歸關(guān)系，計算各供試殺菌劑對煙草黑脛病菌的EC50值。

1.4.3 雙炔酰菌胺對煙草黑脛病的室內(nèi)盆栽防效

室內(nèi)盆栽防效試驗于2020年8月在安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院溫室進(jìn)行。選取生長一致的健康煙株，通過煙株莖基部澆淋的方式施藥。施藥3 d 后，將煙草黑脛病菌游動孢子懸浮液按50 mL/株接種至煙苗莖基部，并用脫脂棉保濕48 h。游動孢子懸浮液接種濃度為106cfu/mL。接種后的煙苗放置于28 ℃溫室中培養(yǎng)30 d 后調(diào)查發(fā)病株數(shù)和嚴(yán)重度。試驗設(shè)置4個處理，分別為：（1）23.4%雙炔酰菌胺懸浮劑8.5 a.i. mg/株；（2）50%烯酰嗎啉可濕性粉劑18.2 a.i. mg/株；（3）25%甲霜靈可濕性粉劑22.7 a.i.mg/株；（4）清水對照。其中處理（2）和處理（3）為對照藥劑。每個處理設(shè)3 次重復(fù)，每個重復(fù)20 株煙苗。按1 100株/667 m2確定處理用藥量。

根據(jù)GB/T 23222—2008［18］進(jìn)行煙草黑脛病嚴(yán)重度分級。病株率、病情指數(shù)和病指防效計算公式如下：

1.5 數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)采用DPS 7.05和Excel 2010統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 煙草黑脛病菌有效殺菌劑的篩選

測定22種供試殺菌劑對煙草黑脛病菌菌絲生長的抑制效果，發(fā)現(xiàn)在供試殺菌劑中，丁吡嗎啉、雙炔酰菌胺、烯酰嗎啉、甲霜靈、氟嗎啉、代森錳鋅和申嗪霉素7 種殺菌劑（5 mg/L）對煙草黑脛病菌菌絲生長的抑制效果較好。由表1可見，在含藥濃度為5 mg/L的OA培養(yǎng)基上，上述7種殺菌劑對煙草黑脛病菌菌絲生長的抑制率均超過70%，其中雙炔酰菌胺和丁吡嗎啉濃度為5 mg/L時對煙草黑脛病菌菌絲生長的抑制率均為100%。烯酰嗎啉、甲霜靈、氟嗎啉、代森錳鋅和申嗪霉素5種殺菌劑濃度為5 mg/L時對煙草黑脛病菌菌絲生長抑制率分別為89.45%、88.62%、82.25%、76.82%和74.46%。其他15種供試殺菌劑濃度為5 mg/L時對煙草黑脛病菌菌絲生長的抑制率均低于50%。

表1 供試22種殺菌劑對煙草黑脛病菌菌絲生長的抑制效果Tab.1 Inhibitory effects of 22 fungicides on mycelial growth of P. parasitica var. nicotianae

2.2 有效殺菌劑的室內(nèi)毒力測定

根據(jù)初篩結(jié)果，進(jìn)一步測定了丁吡嗎啉、雙炔酰菌胺、烯酰嗎啉、甲霜靈、氟嗎啉、代森錳鋅和申嗪霉素等7 種殺菌劑對煙草黑脛病菌的毒力。由表2 可見，7種殺菌劑對煙草黑脛病菌菌絲生長均具有較好的抑制作用。EC50值從大到小依次為：氟嗎啉＞申嗪霉素＞甲霜靈＞代森錳鋅＞丁吡嗎啉＞烯酰嗎啉＞雙炔酰菌胺。其中雙炔酰菌胺對黑脛病菌菌絲生長的EC50值（0.018 0 mg/L）最小，抑制效果最好；其次是烯酰嗎啉，EC50值為0.783 0 mg/L，而氟嗎啉對煙草黑脛病菌的EC50值最高，為2.023 0 mg/L。

表2 7種殺菌劑對煙草黑脛病菌的毒力測定Tab.2 Toxicity of 7 fungicides to P. parasitica var. nicotianae

2.3 雙炔酰菌胺對煙草黑脛病的室內(nèi)盆栽防效

由表3可見，未經(jīng)殺菌劑處理的空白對照煙株黑脛病發(fā)病率為71.67%，病情指數(shù)為31.67。雙炔酰菌胺、烯酰嗎啉和甲霜靈澆淋處理的煙株黑脛病發(fā)病率和病情指數(shù)均顯著低于空白對照。雙炔酰菌胺對煙草黑脛病的室內(nèi)盆栽防效顯著高于對照殺菌劑烯酰嗎啉和甲霜靈，其病指防效為80.11%。對照藥劑烯酰嗎啉和甲霜靈對煙草黑脛病的室內(nèi)盆栽防效差異不顯著，防效分別為64.89%和66.05%。

表3 雙炔酰菌胺對煙草黑脛病的盆栽防效Tab.3 Control effects of mandipropamid on tobacco black shank in pot experiments

3 討論

通過菌絲生長速率法測定了22種殺菌劑對煙草黑脛病菌菌絲生長的抑制效果，發(fā)現(xiàn)雙炔酰菌胺、丁吡嗎啉、烯酰嗎啉、代森錳鋅、甲霜靈、氟嗎啉和申嗪霉素7種殺菌劑對煙草黑脛病菌具有明顯的抑制作用，其中申嗪霉素對煙草黑脛病菌的毒力與俞芳菲等［19］報道的結(jié)果存在一定差異，推測原因可能與供試煙草黑脛病菌采自不同地區(qū)，對供試藥劑的敏感性存在差異有關(guān)；烯酰嗎啉對煙草黑脛病菌菌絲生長的抑制作用與郭敬等［20］的研究結(jié)果大致相同。本研究中發(fā)現(xiàn)雙炔酰菌胺對煙草黑脛病菌菌絲生長具有強(qiáng)烈的抑制作用，且效果優(yōu)于丁吡嗎啉、烯酰嗎啉、代森錳鋅、甲霜靈、氟嗎啉和申嗪霉素等化學(xué)殺菌劑。雖然雙炔酰菌胺還未被登記用于煙草黑脛病的防治，鮮見用其防治煙草黑脛病的報道，但本研究中雙炔酰菌胺對煙草黑脛病菌的 EC50值（0.018 0 mg/L）與韓秀英等［21］報道的山東省4地115株辣椒疫霉對雙炔酰菌胺敏感程度（EC50平均值為0.012 mg/L）的研究結(jié)果基本一致。此外，盆栽防效試驗結(jié)果顯示，23.4%雙炔酰菌胺懸浮劑可有效控制煙草黑脛病的危害，相對防效達(dá)80.11%，明顯高于對照藥劑50%烯酰嗎啉懸浮劑和25%甲霜靈可濕性粉劑，這與宋曉兵等［22］在荔枝霜疫霉病和路粉等［23］在黃瓜霜霉病上的研究結(jié)果基本一致。可見，在煙草黑脛病菌對烯酰嗎啉、甲霜靈等化學(xué)殺菌劑抗藥性逐年加重的情況下［24-27］，雙炔酰菌胺對煙草黑脛病的防治有一定潛力。

4 結(jié)論

22 種供試殺菌劑對煙草黑脛病菌菌絲生長均有一定的抑制作用，其中，氟嗎啉、申嗪霉素、甲霜靈、代森錳鋅、丁吡嗎啉、烯酰嗎啉和雙炔酰菌胺7種殺菌劑對煙草黑脛病菌菌絲生長的抑制作用明顯，EC50值分別為2.023 0、1.923 0、1.808 2、1.758 0、1.400 0、0.783 0和0.018 0 mg/L。23.4%雙炔酰菌胺懸浮劑對煙草黑脛病的病指防效（80.11%）顯著高于對照藥劑50%烯酰嗎啉懸浮劑（64.89%）和25%甲霜靈可濕性粉劑（66.05%），雙炔酰菌胺可有效控制煙草黑脛病的危害。