湖北雪茄煙葉致霉菌分離鑒定及芽胞桿菌屬拮抗菌株篩選

張岱源，葉長文，李 棟，劉丹丹，魏雪團，黃 闊*

1. 中國煙草總公司鄭州煙草研究院，鄭州市高新技術產業開發區楓楊街2 號 450001

2. 華中農業大學食品科學技術學院，武漢市洪山區獅子山街1 號 430070

雪茄煙是由雪茄煙葉卷制而成的煙草制品，雪茄煙葉品質是決定雪茄煙質量的關鍵［1］。然而，雪茄煙葉營養物質豐富，在適宜環境條件下極易滋生霉菌［2］，導致煙葉組織結構被破壞，出現霉腐臭味，且部分霉菌還可能產生毒素［3-4］，嚴重影響雪茄煙煙葉原料品質［5-6］。煙葉霉變防控方法主要包括物理防霉法、化學防霉法和生物防霉法［7-9］。其中，物理防霉法主要包括輻照防霉法和微波防霉法，這兩種方法可能會影響煙葉品質，且存在效果不佳、能耗大和成本高等問題，因此未被推廣［10］。化學防霉法通常利用山梨酸（鹽）類、苯甲酸（鹽）類及羥基苯甲酸（鹽）類等防霉劑干預霉菌的生長，但這些防霉劑對煙葉的感官品質易造成不良影響，故其應用受到限制［11］。生物防霉法主要利用微生物或微生物的代謝產物抑制或殺死霉菌，從而防止煙葉霉變的發生，該方法具有安全環保、高效無污染等優點［12］，應用前景廣闊。其中，芽胞桿菌屬（Bacillus）微生物具有對霉菌拮抗能力強、安全性高等特點，在拮抗霉菌的菌株中優勢明顯［13-16］。陳倩倩等［17］通過瓊脂平板打孔法發現枯草芽胞桿菌FJAT-5561（Bacillus subtilisFJAT-5561）對青霉屬（Penicillium）霉菌有較強拮抗能力；趙文姬［18］采用平板對峙法篩選到一株解淀粉芽胞桿菌B055（Bacillus amyloliquefaciensB055），該菌株對烤煙煙葉具有良好的防霉效果；盧燦華等［19］從烤煙內生細菌中分離得到一株枯草芽胞桿菌Z002（Bacillus subtilisZ002），該菌株對烤煙煙葉致霉菌少根根霉（Rhizopus arrhizus）的防效高達97%。然而，利用芽胞桿菌屬（Bacillus）微生物對雪茄煙葉進行霉變防控的相關研究還鮮見報道。因此，分離、純化湖北霉變雪茄煙葉中的霉菌，利用純化后的霉菌對煙葉進行回接侵染確定致霉菌，采用牛津杯抑菌法篩選對致霉菌拮抗能力強且具廣譜抗霉能力的芽胞桿菌屬（Bacillus）微生物，并分析其對雪茄煙葉的防霉效果，旨在為雪茄煙葉的生物防霉提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 雪茄煙葉樣品采集

雪茄煙葉樣品采集于湖北省恩施市來鳳縣雪茄煙發酵工廠，茄芯煙葉品種為楚雪14 號，茄衣煙葉品種為楚雪10 號，取樣時間為2021 年10 月21日。選取湖北省宜昌市發酵前、后茄芯和十堰市發酵前、后茄衣4種霉變樣品用于霉菌分離。另外，選取宜昌市發酵前茄衣、發酵后茄衣、發酵后茄芯和十堰市發酵前茄衣4種正常未霉變雪茄煙葉樣品用于拮抗芽胞桿菌屬（Bacillus）微生物篩選、煙葉抗霉菌侵染能力分析、霉菌致霉性分析及拮抗菌株防霉效果分析。取各煙葉樣品2 kg 裝于無菌采樣袋，使用低溫保藏箱轉移至實驗室并保存于-20 ℃冰箱中。

1.1.2 培養基配方

孟加拉紅瓊脂培養基：蛋白胨5 g/L，葡萄糖10 g/L，磷酸二氫鉀1 g/L，硫酸鎂（無水）0.5 g/L，孟加拉紅0.033 g/L，氯霉素0.1 g/L，瓊脂20 g/L；馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養基：馬鈴薯（去皮）200 g/L，葡萄糖20 g/L，氯霉素0.1 g/L，瓊脂20 g/L；LB 液體培養基：蛋白胨10 g/L，酵母粉5 g/L，氯化鈉10 g/L；LB固體培養基：蛋白胨10 g/L，酵母粉5 g/L，氯化鈉10 g/L，瓊脂15 g/L；沙氏液體培養基：蛋白胨10 g/L，葡萄糖40 g/L；沙氏固體培養基：蛋白胨10 g/L，葡萄糖40 g/L，瓊脂15 g/L。

1.2 試驗方法

1.2.1 雪茄煙葉中致霉菌的分離、純化與鑒定

1.2.1.1 雪茄煙葉中霉菌的分離、純化

參照GB 4789.15—2016［20］的方法，稱取4 種霉變雪茄煙葉樣品各25 g，分別加入225 mL 無菌水，充分振蕩后將所得液體按照10-2、10-3和10-4進行梯度稀釋，采用平板傾注法將稀釋液分別接種于孟加拉紅瓊脂培養基平板，28 ℃恒溫培養3 d 后對各平板中的菌落進行計數，選擇數量多且形態差異明顯的5 個單菌落，分別進行純化得到進一步純化的單菌落，將其分別命名為ZT-1、ZT-2、ZT-3、ZT-4 和ZT-5。

1.2.1.2 雪茄煙葉中霉菌的鑒定

形態學鑒定：將得到的5株霉菌分別接種于5個PDA培養基平板中央，28 ℃恒溫培養3 d，觀察霉菌菌落顏色，并在3 d內每隔12 h記錄各霉菌的生長情況。挑取各菌落邊緣菌絲分別制備玻片，使用光學顯微鏡（德國Leica 公司）觀察霉菌孢子形態和產孢結構。

分子生物學鑒定：使用真菌基因組DNA抽提試劑盒（上海生工生物工程有限公司）提取5株霉菌的基因組DNA，并以提取的DNA 為模板，利用引物ITS1（5＇-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3＇）和ITS4（5＇-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3＇）對霉菌ITS 區進行PCR 擴 增。PCR 反 應 體 系：5 μL 5×TransStart?FastPfuBuffer，2.5 μL dNTPs（2.5 mmol/L），1 μL 上游引物（10 μmol/L），1 μL下游引物（10 μmol/L），1 μL模板DNA，1 μLFastPfuDNA Polymerase（2.5 U/μL），加ddH2O 補至25 μL。PCR 反應程序：95 ℃預變性5 min；95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，循環30 次；72 ℃延伸5 min。PCR 產物送至北京擎科生物科技股份有限公司進行測序，使用NCBI BLAST 在線工具將測序結果與NCBI 數據庫中已有真菌的ITS 序列進行同源性比對。使用MEGA 7.0軟件構建系統發育樹。

1.2.1.3 不同雪茄煙葉抗霉菌侵染能力

稱取4 種煙葉各5 g 分別置于4 個250 mL 錐形瓶中，在瓶口處噴灑3.5 mL 1.2.1.1 節中得到的5 株霉菌的混合孢子懸浮液（孢子濃度2×104CFU/mL）。上述操作重復3次，28 ℃恒溫培養箱放置4 d。煙葉表面無霉菌菌絲覆蓋且煙葉無霉臭味則該煙葉抗霉菌侵染能力強，煙葉表面有霉菌菌絲覆蓋且煙葉有霉臭味則該煙葉抗霉菌侵染能力弱［21］。

1.2.1.4 雪茄煙葉中霉菌的致霉性

稱取6 份1.2.1.3 節中抗霉菌侵染能力弱的煙葉各5 g 分別置于6 個250 mL 錐形瓶，分別對各煙葉進行處理（處理1-1：噴灑3.5 mL無菌水；處理1-2：噴灑3.5 mL 菌株ZT-3 孢子懸浮液，孢子濃度為2×104CFU/mL；處理1-3：噴灑3.5 mL 菌株ZT-5 孢子懸浮液，孢子濃度為2×104CFU/mL；處理1-4：噴灑3.5 mL菌株ZT-1 孢子懸浮液，孢子濃度為2×104CFU/mL；處理1-5：噴灑3.5 mL菌株ZT-2孢子懸浮液，孢子濃度為2×104CFU/mL；處理1-6：噴灑3.5 mL菌株ZT-4孢子懸浮液，孢子濃度為2×104CFU/mL）。上述操作重復3次，28 ℃恒溫培養箱放置4 d。煙葉表面無霉菌菌絲覆蓋且煙葉無霉臭味則該霉菌致霉性弱，煙葉表面有霉菌菌絲覆蓋且煙葉有霉臭味則該霉菌致霉性強。

1.2.2 拮抗芽胞桿菌屬（Bacillus）微生物的篩選與鑒定

1.2.2.1 拮抗芽胞桿菌屬（Bacillus）微生物的分離、純化

稱取2 g 未霉變雪茄煙葉，加入18 mL 無菌水，37 ℃、180 r/min 搖床振蕩2 h，將其按照體積分數3%接種至5 mL LB液體培養基，37 ℃、180 r/min搖床振蕩12 h。將所得液體按照10-2、10-3和10-4進行梯度稀釋后分別涂布于LB 固體培養基平板，37 ℃恒溫培養12 h。挑取各平板上的單菌落分別進行純化，得到進一步純化的單菌落并編號。

1.2.2.2 拮抗芽胞桿菌屬（Bacillus）微生物的初步篩選

采用牛津杯抑菌法［22］，將10 mL 加熱后冷卻至40 ℃的沙氏固體培養基與100 μL 1.2.1.4 節中致霉性強的霉菌孢子懸浮液（孢子濃度2×105CFU/mL）混合后倒入直徑為90 mm的培養皿中。將牛津杯置于凝固后的培養基上，再次倒入40 ℃沙氏固體培養基，待培養基凝固后取出牛津杯，培養基平板上形成瓊脂孔，將1.2.2.1 節中芽胞桿菌屬（Bacillus）菌株的菌液（菌液濃度108CFU/mL）加入瓊脂孔中。28 ℃培養5 d 后挑選出能形成抑菌圈的芽胞桿菌屬（Bacillus）菌株。

1.2.2.3 拮抗芽胞桿菌屬（Bacillus）微生物的抑菌譜

采用牛津杯抑菌法，測量初步篩選出的芽胞桿菌屬（Bacillus）菌株對5 株霉菌產生的抑菌圈直徑，挑選具有廣譜抗霉能力的芽胞桿菌屬（Bacillus）菌株。

1.2.2.4 拮抗芽胞桿菌屬（Bacillus）微生物的鑒定

使用細菌基因組DNA抽提試劑盒（南京諾唯贊生物科技有限公司）提取菌株的基因組DNA，并以提 取 的DNA 為 模 板，利 用 引 物7F（5＇-CAGAG TTTGATCCTGGCT- 3＇）和1540R（5＇- AGGAGGTG ATCCAGCCGCA-3＇）進行PCR擴增。PCR反應體系、反應程序與1.2.1.2節相同。

PCR產物送至北京擎科生物科技股份有限公司進行測序，使用NCBI BLAST 在線工具將測序結果與NCBI 數據庫中已有細菌的16S 序列進行同源性比對。使用MEGA 7.0軟件構建系統發育樹。

1.2.3 拮抗芽胞桿菌屬（Bacillus）微生物對雪茄煙葉的防霉效果

稱取4 份1.2.1.3 節中抗霉菌侵染能力弱的煙葉各5 g 分別置于4 個250 mL 錐形瓶中，對煙葉噴灑3.5 mL 1.2.1.4 節中致霉性強的霉菌孢子懸浮液（孢子濃度2×104CFU/mL），靜置2 h 后，分別對各煙葉進行處理（處理2-1：噴灑3.5 mL無菌水；處理2-2：噴灑3.5 mL濃度為107CFU/mL的拮抗菌菌懸液；處理2-3：噴灑3.5 mL 濃度為108CFU/mL 的拮抗菌菌懸液；處理2-4：噴灑3.5 mL濃度為109CFU/mL的拮抗菌菌懸液）。上述操作重復3次，28 ℃恒溫培養箱放置4 d。煙葉表面無霉菌菌絲覆蓋且煙葉無霉臭味則該濃度下拮抗菌菌懸液防霉效果強，煙葉表面有霉菌菌絲覆蓋且煙葉有霉臭味則該濃度下拮抗菌菌懸液防霉效果弱。

2 結果與分析

2.1 雪茄煙葉中致霉菌的分離、純化與鑒定

2.1.1 雪茄煙葉中霉菌的分離、純化與鑒定

5 株霉菌在PDA 培養基上生長3 d 的菌落形態和鏡檢結果如圖1所示。菌株ZT-1在PDA培養基上生長速度中等，菌落表面由內向外依次為褐色、青色和白色，孢子呈圓形。菌株ZT-2在PDA培養基上生長速度較慢，菌落邊緣呈白色，內部呈藍綠色，菌落有放射狀溝紋，分生孢子梗多次分枝，形如掃帚。菌株ZT-3在PDA培養基上生長速度中等，菌落呈灰綠色，分生孢子梗多次分枝，形如掃帚。菌株ZT-4 在PDA培養基上生長速度較快，菌落邊緣呈白色，內部呈灰綠色，孢子近球形。菌株ZT-5在PDA培養基上生長速度快，菌落整體呈黑色，邊緣呈淺黃色，分生孢子梗頂端膨大。

圖1 菌株ZT-1、ZT-2、ZT-3、ZT-4和ZT-5的菌落和鏡檢圖Fig.1 Colonies and microscopic images of strains ZT-1, ZT-2, ZT-3, ZT-4 and ZT-5

使用NCBI BLAST 在線工具進行同源性分析，發現菌株ZT-1、ZT-2、ZT-3、ZT-4 和ZT-5 的ITS 序列分 別 與 聚 多 曲 霉（Aspergillus sydowii）（NR_131259.1）、產黃青霉（Penicillium chrysogenum）（NR_077145.1）、繩 狀 籃 狀 菌（Talaromyces funiculosus）（NR_103678.2）、云南木霉（Trichoderma yunnanense）（NR_134419.1）和 黑 曲 霉（Aspergillus niger）（NR_111348.1）的ITS 序列相似度均為100%。系統發育進化樹（圖2）進一步證明了菌株ZT-1、ZT-2、ZT-3、ZT-4和ZT-5分別為聚多曲霉（Aspergillus sydowii）、產黃青霉（Penicillium chrysogenum）、繩狀籃狀菌（Talaromyces funiculosus）、云 南 木霉（Trichoderma yunnanense）和黑曲霉（Aspergillus niger）。

圖2 菌株ZT-1、ZT-2、ZT-3、ZT-4和ZT-5的系統發育進化樹Fig.2 Phylogenetic evolutionary tree of strains ZT-1, ZT-2, ZT-3, ZT-4 and ZT-5

2.1.2 不同雪茄煙葉抗霉菌侵染能力

接種混合霉菌孢子懸浮液4 d 后的雪茄煙葉見圖3。湖北省宜昌市發酵前茄衣煙葉表面有霉菌菌絲覆蓋，且煙葉有嚴重霉臭味，而湖北省宜昌市發酵后茄芯煙葉、湖北省宜昌市發酵后茄衣煙葉和湖北省十堰市發酵前茄衣煙葉表面無霉菌菌絲覆蓋，且煙葉無霉臭味。由此可見，湖北省宜昌市發酵前茄衣煙葉抗混合霉菌孢子懸浮液侵染能力弱，因此選取湖北省宜昌市發酵前茄衣煙葉為重點防霉對象。

圖3 接種混合霉菌孢子懸浮液4 d后的雪茄煙葉Fig.3 Cigar tobacco inoculated with mixed mold spore suspensions for 4 days

2.1.3 雪茄煙葉中霉菌的致霉性

不同霉菌孢子懸浮液處理4 d 后的雪茄煙葉見圖4。處理1-2和處理1-3中的煙葉表面有霉菌菌絲覆蓋，且煙葉有嚴重的霉臭味。而處理1-1、處理1-4、處理1-5 和處理1-6 中的煙葉表面無霉菌菌絲覆蓋，且煙葉無霉臭味。可見，處理1-2和處理1-3中的霉菌均有強致霉性。其中，處理1-2中的煙葉表面菌絲較處理1-3更明顯，故選取處理1-2中的霉菌［繩狀籃狀菌（Talaromyces funiculosus）］作為后續試驗中侵染雪茄煙葉的霉菌，處理1-3 中的霉菌［黑曲霉（Aspergillus niger）］作為初步篩選拮抗菌株的指示菌。

圖4 不同霉菌孢子懸浮液處理后的雪茄煙葉Fig.4 Gigar tobacco treated with different mold spore suspensions

2.2 拮抗芽胞桿菌屬（Bacillus）微生物的篩選與鑒定

2.2.1 拮抗芽胞桿菌屬（Bacillus）微生物的初步篩選與抑菌譜分析

通過牛津杯抑菌法篩選出6 株芽胞桿菌屬（Bacillus）微生物。由圖5 和表1 可見，6 株芽胞桿菌屬（Bacillus）微生物對黑曲霉（Aspergillus niger）的拮抗能力較強，且具有廣譜抗霉能力。其中菌株DY-9對5種霉菌的拮抗能力均最強。

表1 6株拮抗菌株的抑菌譜①Tab.1 Antifungal spectrum of 6 antagonistic strains

圖5 6株拮抗菌株對不同霉菌的拮抗效果Fig.5 Antagonistic effects of 6 antagonistic strains against different molds

2.2.2 拮抗芽胞桿菌屬（Bacillus）微生物的鑒定

使用NCBI BLAST 在線工具進行同源性分析，發現菌株DY-1、DY-4、DY-5 和DY-7 的16S rDNA 基因序列分別與貝萊斯芽胞桿菌（Bacillus velezensis）（MT114570.1）、貝萊斯芽胞桿菌（Bacillus velezensis）（KY962336.1）、貝萊斯芽胞桿菌（Bacillus velezensis）（CP053764.1）和貝萊斯芽胞桿菌（Bacillus velezensis）（KY962336.1）的16S rDNA 基因序列相似性達99.73%、98.25%、99.53%和99.79%。DY-9 和DY-10的16S rDNA 基因序列與解淀粉芽胞桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）（KY085968.1）的16S rDNA 基 因序列相似性分別為99.93%和99.80%。系統發育進化樹（圖6）進一步證明了菌株DY-1、DY-4、DY-5 和DY-7 為貝萊斯芽胞桿菌（Bacillus velezensis），菌株DY- 9 和DY- 10 為解淀粉芽胞桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）。

圖6 菌株DY-1、DY-4、DY-5、DY-7、DY-9和DY-10的系統發育進化樹Fig.6 Phylogenetic evolutionary tree of strains DY-1, DY-4, DY-5, DY-7, DY-9 and DY-10

2.3 拮抗芽胞桿菌屬（Bacillus）微生物對雪茄煙葉的防霉效果

不同濃度解淀粉芽胞桿菌DY-9（Bacillus amyloliquefaciensDY-9）菌懸液處理4 d 后的雪茄煙葉見圖7。處理2-1、處理2-2 和處理2-3 中的煙葉表面均有霉菌菌絲覆蓋，且煙葉有嚴重的霉臭味。而處理2-4中的煙葉表面無霉菌菌絲覆蓋，且煙葉無霉臭味，說明處理2-4 中濃度為109CFU/mL 的拮抗菌菌懸液防霉效果最佳。

圖7 不同濃度解淀粉芽胞桿菌DY-9（Bacillus amyloliquefaciens DY-9）菌懸液對雪茄煙葉的防霉效果Fig.7 Anti-mildew effects of different concentrations of Bacillus amyloliquefaciens DY-9 suspensions at different concentrations on cigar tobacco

3 討論

從湖北省十堰市和宜昌市霉變雪茄煙葉樣品中共分離、純化得到5種霉菌，經形態學和分子生物學鑒定為聚多曲霉（Aspergillus sydowii）、產黃青霉（Penicillium chrysogenum）、繩狀籃狀菌（Talaromyces funiculosus）、云南木霉（Trichoderma yunnanense）和黑曲霉（Aspergillus niger），這與馮克寬等［23］研究發現蘭州倉儲水煙中檢出率最高的霉菌為黑曲霉（Aspergillus niger） 和 產 黃 青 霉（Penicillium chrysogenum）的結果相似，也與朱桂寧等［24］報道的廣西地區煙倉儲存煙葉中占比較高的霉菌種類較為一致，部分不一致的結果如溜曲霉（Aspergillus tamarii）在本研究中不是占比較高的霉菌，可能是地區和煙葉品種的差異所致。用分離、純化得到的5種霉菌對煙葉進行回接侵染，發現繩狀籃狀菌（Talaromyces funiculosus）和黑曲霉（Aspergillus niger）對湖北省宜昌市發酵前茄衣煙葉具有強致霉性，這與趙文姬［18］對云南部分地區霉變煙葉樣品進行的研究結果一致。湖北省宜昌市發酵前茄衣煙葉比發酵后茄芯、發酵后茄衣煙葉以及十堰市發酵前茄衣煙葉在相同處理條件下更易被霉菌侵染，這與孔凡玉等［11］研究中品種、產地及部位等會影響煙葉發生霉變的速度，且發酵前煙葉更易霉變的結論相一致。

本研究中解淀粉芽胞桿菌DY-9（Bacillus amyloliquefaciensDY-9）對5 種霉菌均具有最強的拮抗能力，這與報道的解淀粉芽胞桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）具有廣譜抗霉能力一致［25-27］。解淀粉芽胞桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）抗霉能力強的原因可能是該菌能產生脂肽類抗生素、抑菌蛋白等多種物質［28-29］，但關于拮抗菌株的防霉作用機理和防霉代謝產物等問題仍有待進一步研究。

4 結論

從湖北省十堰市和宜昌市霉變雪茄煙葉中共分離、純化得到5 株霉菌，經鑒定分別為聚多曲霉（Aspergillus sydowii）、產 黃 青 霉（Penicillium chrysogenum）、繩狀籃狀菌（Talaromyces funiculosus）、云 南 木 霉（Trichoderma yunnanense）和 黑 曲 霉（Aspergillus niger），用5株霉菌對煙葉進行回接侵染，結果表明湖北省宜昌市發酵前茄衣煙葉更易發生霉變，且繩狀籃狀菌（Talaromyces funiculosus）與黑曲霉（Aspergillus niger）對該煙葉有強致霉性。采用牛津杯抑菌法篩選出6株芽胞桿菌屬（Bacillus）微生物，對黑曲霉（Aspergillus niger）有較強拮抗能力，還具有廣譜抗霉能力，其中解淀粉芽胞桿菌DY-9（Bacillus amyloliquefaciensDY-9）對分離、純化得到的各霉菌均有最強的拮抗能力。濃度為109CFU/mL時菌株DY-9菌懸液對雪茄煙葉的防霉效果最佳。