鉆地風三萜類化學成分及含量測定研究*

王飄,李思琪,王五兵,李昌芬,張意雪,易志恒,陳凌云

(1.云南中醫(yī)藥大學中藥學院,昆明 650500;2.云南省高校外用給藥系統(tǒng)與制劑技術研究重點實驗室,昆明 650500;3.賽靈藥業(yè)科技集團股份有限公司,云南玉溪 653100)

鉆地風[RubusellipticusSmith.varobcordatus(Franch.) Focke]為薔薇科懸鉤子屬植物栽秧泡的干燥根,又名黃鎖莓根,彝醫(yī)稱之為“草老奢景”或“高斯諾”,意譯為治腰酸腿痛藥。產地主要分布于云南、貴州、廣西和四川,多生長在海拔300～2700 m的山谷林中、山坡路邊或河邊灌叢中[1],始載于《滇南本草》,味酸,性溫,走經絡,舒筋活絡,收澀止痢,用于治筋骨疼痛、慢性腹瀉、久痢、帶下及黃水瘡。

鉆地風中主要含有三萜類[2-3]及異黃酮類化合物[4],相關文獻較少且年份久遠。在《云南省中藥材標準》(2005年版)及《貴州省中藥材、民族藥材質量標準》(2003年版)中有記載鉆地風質量標準[5-6],前者鑒別項下采用鉆地風對照藥材作為對照進行薄層鑒別,后者僅對其進行顯微鑒別,均難以評價鉆地風內在質量。因此,需進一步探索鉆地風的化學組成,以期尋找有效活性成分,進行含量比較選擇合適的質控指標,為完善鉆地風藥材質量標準提供試驗依據(jù),有利于其資源更好開發(fā)及利用。

1 儀器與試藥

Agilent 1100 高效液相色譜儀,配有DAD型檢測器(美國 Agilent 公司);AvanceIII600 MHz超導磁共振儀(瑞士布魯克公司);電子分析天平[奧豪斯儀器(常州)有限公司,感量:0.1 mg];AB265-S電子分析天平(瑞士梅特勒-托利多公司,感量:0.01 mg);SK2200HP超聲儀(上海科導超聲儀器有限公司);柱色譜硅膠(200～300目篩,青島海洋化工廠);MCI小孔樹脂(MCI-gel CHO-20P,日本三菱公司);LH-20羥丙基葡聚糖凝膠(Sephadex LH-20,Pharmacia公司);所用試劑均為分析純或色譜純,水為娃哈哈純凈水。

分離所用鉆地風于2019年7月采集在羅平,其余鉆地風購于藥材市場,產地分別為峨山、曲靖、紅河、普洱,經云南中醫(yī)藥大學錢子剛教授鑒定為鉆地風RubusellipticusSmith.varobcordatus(Franch.) Focke的干燥根,標本保存于云南中醫(yī)藥大學中藥學院 (F-201907125)。

2 方法與結果

2.1化學成分研究

2.1.1提取與分離 干燥的鉆地風(1.5 kg)粉碎,用三氯甲烷-甲醇(1：1)混合溶劑常溫浸提,減壓濃縮得浸膏,加水混懸后依次用石油醚、乙酸乙酯各萃取3次,回收各部分溶劑。取乙酸乙酯部位經MCI柱層析,以20%,60%,80%甲醇溶液和丙酮溶液進行梯度洗脫。80%甲醇部位經硅膠柱層析,以石油醚-丙酮梯度洗脫,再經環(huán)己烷-丙酮(3.5：1～1：1)梯度洗脫得組分A1～6,其中A3經葡聚糖凝膠柱純化,以三氯甲烷-甲醇(1：1)等度洗脫,重結晶得到化合物1(584 mg)。

其余組分剩余量較少,難以繼續(xù)分離,因此另取干燥的鉆地風5 kg,用三氯甲烷-甲醇(1：1)混合溶劑常溫浸提2次,每次5 d,再用乙醇浸提2次,每次3 d,合并減壓濃縮得浸膏。浸膏經大孔樹脂層析,以水、30%、70%、100%甲醇及乙酸乙酯梯度洗,70%甲醇部位(95 g)經硅膠柱層析,以三氯甲烷-甲醇(12：1～6：1)梯度洗脫得組分B1～4。

組分B2經硅膠柱層析,以三氯甲烷-甲醇(8：1～6：1)梯度洗脫,再經三氯甲烷-乙酸乙酯(5：1～2：1)梯度洗脫得組分B2.1～2.4,其中B2.3重結晶得化合物3(2.251 g)。

組分B4經硅膠柱層析,以二氯甲烷-甲醇(10：1～4：1)進行梯度洗脫,再以三氯甲烷-甲醇梯度洗脫,得組分B4.1～4.3,其中B4.2經葡聚糖凝膠柱純化,以三氯甲烷-甲醇(1：1)等度洗脫,重結晶得化合物2(118.3 mg)。

組分B4.1經制備HPLC(C18,205 nm,65%乙腈,3 mL·min-1)純化得到化合物4(17.5 mg)、化合物5(16.1 mg)和化合物6(9.5 mg)。化合物1～5經液相面積歸一化法計算純度分別為99.0%,99.2%,98.5%,98.1%,98.3%。

2.1.2結構鑒定

①化合物1:白色粉末。1H-NMR(500 MHz,DMSO-d6)δ:0.89(3H,s,H23),0.69(3H,s,H24),0.79(3H,s,H25),1.29(3H,s,H27),1.08(3H,s,H29),0.84(3H,d,J=6.5Hz,H30),3.17(1H,s,H18),3.78(1H,d,J=2.0,Hz,H3),4.13(1H,brs,H2),5.73(1H,brs,H12);13CNMR(125 MHz,DMSOd6)δ:41.41(C1),64.71(C2),77.93(C3),38.02(C4),47.68(C5),18.54(C6),32.49(C7),39.06(C8),46.56(C9),37.82(C10),23.18(C11),126.81(C12),138.67(C13),41.6(C14),28.89(C15),25.17(C16),46.91(C17),53.21(C18),71.67(C19),41.2(C20),25.9(C21),37.28(C22),28.15(C23),21.86(C24),16.3(C25),16.67(C26),24.09(C27),179.66(C28),26.42(C29),16.13(C30)。以上數(shù)據(jù)與文獻[7]報道基本一致,故鑒定該化合物為薔薇酸。

②化合物2:白色粉末。1H-NMR(400 MHz,CD3OD)δ:5.35(1H,d,J=8.0 Hz,H1′),5.33(1H,brs,H12),2.54(1H,s,H18),2.64(1H,m,H3),1.36(3H,s,H27),1.23(3H,s,H29),1.01(3H,d,H25),1.00(3H,d,H23),0.95(3H,d,J=6.4 Hz,H30),0.89(3H,s,H26),0.79(3H,s,H24);13CNMR(CD3OD,100 MHz)δ:42.9(C1),67.3(C2),80.3(C3),39.6(C4),49.0(C5),22.6(C6),34.2(C7),41.6(C8),48.4(C9),39.5(C10),24.9(C11),129.8(C12),139.8(C13),42.7(C14),29.8(C15),26.7(C16),48.5(C17),55.1(C18),73.8(C19),43.0(C20 ),27.3(C21),38.4(C22),29.4(C23),16.8(C24),17.1(C25),19.4(C26),24.9(C27),178.7(C28),27.2(C29),17.8(C30),95.9(C1′),74.0(C2′),78.7(C3′),71.3(C4′),78.4(C5′),62.6(C6′)。以上數(shù)據(jù)與文獻[8]報道基本一致,故鑒定該化合物為刺梨苷(kaiiichigeside F1)。

③化合物3:白色粉末。1H-NMR(400 HMz,CD3OD)δ:1.36(3H,s,H27),1.23(3H,s,H29)1.06(3H,s,H25),0,95(3H,d,J=8 Hz,H30),0.80(3H,s,H26),0.72(3H,s,H24),5.33(1H,overlapped,H12),5.35(1H,s,H28);13CNMR(400MHz,CD3OD)δ:48.12(C1),69.87(C2),78.47(C3),44.26(C4),49.5(C5),19.4(C6),33.69(C7),41.43(C8),47.94(C9),39.15(C10),24.89(C11),129.67(C12),139.87(C13),42.95(C14),29.78(C15),26.69(C16),47.29(C17),55.12(C18),74.02(C19),43.08(C20),27.36(C21),38.45(C22),66.69(C23),14.0(C24),17.84(C25),17.76(C26),24.96(C27),178.7(C28),27.24(C29),16.74(C30),95.94(C1′),78.3(C2′),78.55(C3′),71.23(C4′),78.55(C5′),62.63(C6′)。以上數(shù)據(jù)與文獻[9]報道基本一致,故鑒定該化合物為苦莓苷F1。

④化合物4:白色粉末。1H-NMR(600 MHz,MeOD)δ:5.32(s,1H,H1′),5.30(s,1H,H12),3.80(s,1H,H6′),3.78(s,1H,H3),3.67(dd,J=12.0,4.6 Hz,2H,H23),3.53(s,1H,H5′),3.51(s,1H,H4′),2.60(td,J=13.3,4.1 Hz,2H,H16),2.50(s,1H,H18),1.33(s,3H,H27),1.19(s,3H,H29),0.97(s,3H,H25),0.92(d,J=6.6 Hz,3H,H30),0.77(s,3H,H26),0.70(s,3H,H24);13C-NMR(151 MHz,MeOD)δ:178.71(C28),139.79(C13),129.83(C12),95.94(C1′),78.74(C5′),78.46(C3′),74.21(C3),74.01(C2′),73.79(C19),71.27(C4′),67.62(C23),62.57(C6′),55.13(C18),50.00(C5),48.98(C17),48.66(C9),43.43(C20),43.10(C14),42.86(C8),41.36(C4),39.72(C1),38.48(C10),38.02(C22),33.80(C7),29.83(C15),27.60(C21),27.37(C2),27.21(C29),26.68(C16),24.85(C27),19.43(C6),17.79(C26),16.75(C25),16.48(C30),12.87(C24)。以上數(shù)據(jù)與文獻[10]報道基本一致,故鑒定該化合物為rotundic acid-28-O-β-D-glucopyranosyl ester。

⑤化合物5:白色粉末。1HNMR(600 MHz,MeOD)δ:5.35(s,1H,H1′),5.33(s,1H,H12),3.80(s,1H,H2)2.93(d,J=9.5 Hz,1H,H3),2.54(s,1H,H18),1.35(s,3H),1.22(s,3H),1.03(s,6H),0.95(d,J=6.7 Hz,3H),0.83(s,3H),0.80(s,3H);13CNMR(151 MHz,MeOD)δ:178.67(C28),139.86(C13),129.66(C12),95.93(C1′),84.69(C3),78.76(C5′),78.47(C3′),74.01(C2′),73.77(C19),71.20(C4′),69.68(C2),62.56(C6′),56.85(C5),55.11(C18),43.10(C14),42.84(C20),41.43(C8),40.66(C10),39.34(C4),38.46(C22),34.22(C7),29.79(C15),29.45(C23),27.37(C21),27.20(C29),26.65(C16),24.93(C27),24.81(C11),19.84(C6),17.77(C25),17.61(C24),17.29(C26),16.75(C30)。以上數(shù)據(jù)與文獻[11]報道基本一致,故鑒定該化合物為rosamultin。

⑥化合物6:白色粉末。1HNMR(600 MHz,MeOD)δ:5.39(s,1H,H1′),5.37(s,1H,H12),3.80(s,1H,H6′),3.78(s,1H,H2),3.51(s,1H,H23),3.49(s,1H,),3.34(s,6H),1.74(s,3H,H25),1.10(s,3H,H30),1.08(s,3H,H29),1.00(s,3H,H24),0.92(s,3H,H26),0.69(s,3H,H27);13C-NMR(150 MHz,MeOD)δ:176.73(C28),139.81(C13),137.76(C19),134.16(C18),127.66(C12),95.90(C1′),78.81(C3′),78.53(C5′),78.32(C3),74.16(C2′),71.34(C4′),69.94(C2),66.44(C23),62.68(C6′),50.95(C1),50.00(C17),48.65(C5),48.55(C9),45.98(C14),44.30(C4),40.46(C8),39.10(C10),35.96(C16),35.78(C20),35.34(C7),31.72(C22),29.85(C15),27.60(C21),24.46(C11),22.52(C29),19.92(C27),19.12(C25),18.93(C26),18.50(C30),14.18(C24)。以上數(shù)據(jù)與文獻[12]報道基本一致,故鑒定該化合物為2α,3β,23-trihydroxyurs-12,18-dien-28-oic acid 28-O-β-D-glucopyranoside。

2.2HPLC含量測定

2.2.1對照品溶液的制備 分別精密稱取化合物1～5,加甲醇使溶解,制成含薔薇酸、刺梨苷、苦莓苷、rotundic acid-28-O-β-D-glucopyranosyl ester、rosamultin濃度分別為0.660 0,0.345 0,0.397 5,0.180 0,0.195 0 mg·mL-1的混合對照品溶液。

2.2.2供試品溶液的制備 取鉆地風粉末(過60目篩)約1 g,精密稱定,置錐形瓶中,加入甲醇-三氯甲烷(1：1)溶液25 mL,超聲提取30 min,濾過,濾液蒸至近干,加甲醇溶解 并定容至5 mL。

2.2.3色譜條件 色譜柱:C18(250 mm×4.6 mm,5 μm);流動相為乙腈(A):0.1%磷酸溶液(B)(0～13 min:20%→25%A;13～20 min:25%→32%A;20～30 min:32%→35%A;30～40 min:35%→48%A;40～50 min:48%→50%A;50～70 min:50%→95%A);柱溫:25 ℃;檢測波長:203 nm;流速:1 mL·min-1,理論塔板數(shù)以薔薇酸計不低于7 000。色譜圖見圖1。

1.苦莓苷;2.刺梨苷;3.rosamultin;4.rotundic acid-28-O-β-D-glucopyranosyl ester;5.薔薇酸。

2.2.4線性關系及范圍考察 取化合物1～5,制成系列梯度濃度,按“2.2.3”項下色譜條件進行測定,以峰面積(Y)為縱坐標,濃度(X)為橫坐標進行線性回歸。結果見表1。

表1 5種成分線性關系及范圍

2.2.5儀器精密度實驗 取“2.2.1”項下的混合對照品溶液重復進樣6次,按“2.2.3”項下方法進行測定。結果化合物1～5的RSD值分別為 1.2%,1.1%,1.3%,2.1%,1.8%,滿足含量測定的要求。

2.2.6穩(wěn)定性實驗 取“2.2.2”項下供試品溶液,按“2.2.3”項下方法,分別在0,2,4,8,12 h測定化合物1～5的峰面積,結果化合物1～5的RSD分別為2.1%、1.8%、2.1%、2.4%、2.5%,表明供試品溶液中5個成分在12 h內較穩(wěn)定。

2.2.7重復性實驗 取6份鉆地風粉末,按“2.2.2”項下方法,重復測定5個成分含量,得化合物1～5平均含量分別為2.570 3,4.283 9,2.855 2,0.244 3,0.638 4 mg·g-1,RSD分別為2.1%、2.2%、2.8%、3.0%、2.9%。

2.2.8準確度實驗 取已知含量的鉆地風粉末6份各0.5 g,精密稱定,加入適量對照品,平行制備6份供試品溶液,進樣測定后計算樣品的回收率。5種成分的回收率與RSD結果如表2所示。照分析方法驗證指導原則(《中華人民共和國藥典》2020年版四部通則9101),含量較低的組分回收率可適當放寬,待測成分含量小于10 mg·g-1的回收率限度為90%～108%,小于1 mg·g-1的回收率限度為85%～110%,結果顯示符合回收率符合限度標準。

2.2.9樣品含量測定 取不同產地的鉆地風粉末,按照“2.2.2”項下方法分別制備供試品溶液,按照“2.2.3”項色譜條件進樣測定,結果見表3。

表3 各成分含量測定結果

3 討論

本實驗從鉆地風中分離出6個成分,分別是薔薇酸(1)、刺梨苷(2)、苦莓苷(3)、rotundic acid-28-O-β-D-glucopyranosyl ester(4)、rosamultin(5)、2α,3β,23-trihydroxyurs-12,18-dien-28-oic acid 28-O-β-D-glucopyranoside(6),其中rotundic acid-28-O-β-D-glucopyranosyl ester為首次從該植物中分離得到。現(xiàn)代研究表明,三萜類成分大多具有抗氧化、抗炎抗菌等活性[13-15],薔薇酸抗炎鎮(zhèn)痛作用顯著,且具有降血糖活性[16];苦莓苷鎮(zhèn)痛作用優(yōu)于傳統(tǒng)鎮(zhèn)痛藥物阿司匹林和對乙酰氨基酚,在體外顯示明顯的抗腫瘤活性,還可抗風濕和抗順鉑誘發(fā)的腎毒性[17-19]。

為確定各化合物在鉆地風中的含量,使用HPLC-DAD進行含量測定。6個成分均屬于烏蘇烷型三萜化合物,采用全波長進行掃描,選取203 nm為檢測波長;流動相考察了甲醇-水、乙腈-水和乙腈-磷酸溶液對分析結果的影響,結果顯示在乙腈-0.1%磷酸溶液梯度洗脫下,基線平穩(wěn)且各目標峰分離度較好。6個成分中化合物6含量過低未達到基線分離,因此僅建立化合物1～5的含量測定方法。含量測定結果顯示,各個產地的鉆地風中薔薇酸、刺梨苷、苦莓苷含量占比較高,薔薇酸含量最高的產區(qū)為普洱,刺梨苷和苦莓苷含量最高的為峨山。不同產地的鉆地風成分含量差異較大,可能與采集時間、土壤和氣候等因素有關。本研究分離得到的6個成分以及所建立的含量測定可為鉆地風及其相關制劑的開發(fā)應用和質量控制提供依據(jù)。